PJ | SR45a通过免疫基因的选择性剪接提高棉花对大丽黄萎病的抗性

=== 研究结果 ===

进一步从RNA-seq数据中分析了在Vd诱导中经历差异选择性剪接的免疫相关基因。RNA-seq分析揭示了关键的PTI和ETI相关基因，例如GauBAK1、GauCERK1，GauRLK4、GauLRR3、GauWAK14、GauPRL、GauLRR4、GauBIR2和GauNPR3在Vd感染期间产生了多个转录本变体，其特征是不同程度的外显子剪接。通过qRT-PCR检测验证了这些基因剪接率的增加(图2)。

图2.通过Vd感染验证棉花免疫相关基因剪接比的改变。(a)验证Vd感染引起的BAK1基因剪接比的改变。(b) Vd感染期间BAK1的剪接率增加。Vd诱导的BAK1剪接率增强取决于SR45a。结果在VIGS-SR45a和对照植物中使用qRT-PCR得到证实。同种型特异性引物被设计为跨越外显子-外显子连接处，检测未剪接产物的引物被设计为跨越内含子-外显子连接处。(c–l)通过Vd感染验证RLK4(c, d)、CERK1(e, f)、LRR3(g, h)、WAKs14(i, j)、PRL(k, l)基因剪接率的增加。

在Vd感染后的第2天和第3天(2-dpi和3-dpi)，GauSR45a样蛋白(SR45a-L)的表达上调，而其他SR基因的表达没有显著波动(图S8a)。研究人员进一步鉴定了由第3至第8外显子的差别包含产生的六种GauSR45a-L AS变异体(图S9a)

为了研究SR45a-L基因与棉花对萎蔫病(VW)抗性之间的相关性，研究人员进一步分析了分别表现出抗性和敏感性的海岛棉G. barbadense和陆地棉G. hirsutum中SR45a-L同源基因的表达和AS模式。结果显示GbSR45a-L和GhSR45a-L在不同组织中普遍表达(图S8e, f)。由GauSR45a-L或GbSR45a-L启动子驱动的GUS(β-葡萄糖醛酸酶)报告基因可以在Vd感染后在N. benthamiana叶片中表达(图S8g)，GUS染色显示的启动子活性与RNAseq分析中GbSR45a-L转录本的丰度一致。RT-PCR分析显示，通过AS产生了六种转录变异体，并且只有GbSR45a-L1和GbSR45a-L2在Vd感染期间差异性积累。相比之下，敏感抗性的陆地棉中GhSR45a-L的AS模式显著不同(图S9f)。这些结果表明SR45a-L可能在棉花VW抗性中扮演关键角色。

为了探究这些蛋白的细胞定位情况，作者使用融合GFP蛋白表达载体，在N. benthamiana表皮细胞中进行了瞬时表达。结果显示所有异构体都与核定位的AtSR34-RFP共定位。此外，GauSR45aL1和GauSR45a-L2也在细胞质和质膜中被观察到，意味着它们可能具有与其他异构体不同的功能。

图S8.丝氨酸/精氨酸相关基因对Vd感染的响应以及SR45a的表达特征。(a)棉花根部接种Vd菌株V991分离物后，RNA-seq数据中SR基因的热图。(b)棉花感染Vd后RNA-seq数据中SR45a基因各种异构体的诱导活性。(c) RNA-seq数据中GbSR45a基因的表达模式。(d) GhSR45a基因在RNA-seq数据中的表达模式。(e)来自海岛棉不同组织的RNA-seq数据中的GbSR45a基因热图。(f)GhSR45a基因在陆地棉不同组织RNA-seq数据中的热图。(g)烟草叶片中瞬时表达的GauSR45a-likepro-GUS或GbSR45a-likepro-GUS的GUS染色分析。

图S9.棉花SR45a-like基因参与了对Vd感染的响应。(a).SR45a-like的交替剪接mRNA变体。(b)六种SR45a样mRNA变体翻译的蛋白质及结构域分析图。(c)基因的RNA-seq数据与可视剪接接头和基因注释轨迹的Sashimi图。(d-f) RT-PCR分析SR45a-like在G.australe、G. barbadense、G. barbadense、G. hirsutum对Vd感染的反应。对十天大的幼苗接种Vd，并在感染后0、3、6、9、12、24、48、72和96小时对根部取样。

为了进一步检查SR45a是否有助于棉花对VW的抗性，作者采用病毒诱导基因沉默(VIGS)来沉默G. australe和G. barbadense cv.中的SR45a基因。沉默SR45a基因会引起典型症状，包括叶片失绿、卷曲和坏死以及维管束变色(图3a、d)。沉默植株中茎的真菌恢复率(图3c)、相对真菌生物量(图3e)和疾病指数(DI)显著增加(图3f)。

进一步在拟南芥中异位表达了来自G.australe的6个GauSR45a剪接变体，以检查它们在防御Vd感染中的潜在作用。结果表明，GauSR45a-L1或GauSR45a-L2的过表达显著增强了拟南芥的VW抗性(图3g，h)，其特征是在20dpi时显著降低真菌生物量(图3i)和疾病指数(图3j)，但GauSR45a-L2的过表达与GauSR45a-L1的过表达相比，对Vd的抵抗力相对较高(图3g)。综上所述，SR45a-L的GauSR45a-L1和GauSR45a-L2选择性剪接变体正向调节植物对Vd的抗性。

RT-PCR检测了Vd攻击后VIGS-GauSR45a棉花根部免疫相关基因的剪接事件。结果表明，GauSR45沉默棉花中GauBAK1、GauCERK1、GauRLK4、GauLRR3、GauWAK14和GauPRL的AS比率显著减弱(图2)。这些结果表明，GauSR45a赋予棉花对Vd的抗性，主要是通过调节参与PTI、ETI和响应Vd的防御的关键基因的选择性剪接。

图3. SR45a-Like参与棉花针对黄萎病的防御反应。(a) VIGS-GauSR45a、VIGS-GbSR45a和接种Vd V991分离株20天的对照植物的疾病症状。(b) GauSR45a或GbSR45a基因在VIGS沉默和对照植物中的表达。(c) VIGS-GauSR45a、VIGS-GbSR45a基因和对照植物中茎切片的真菌恢复实验。(d)接种V991后VIGS-GbSR45a和对照植物的导管变色。(e)使用V991在20dpi下对VIGS-GauSR45a、VIGS-GbSR45a基因和对照植物根部的Vd生物量进行定量。(g) GauSR45a-L2-OE拟南芥增强了对大丽黄萎病菌感染的抵抗力。(h)GauSR45a在转基因拟南芥和野生型(WT)中的相对表达水平。(i)在20dpi接种V991时对转基因拟南芥和WT植物根部的Vd生物量进行定量。(j) V991感染后20dpi转基因拟南芥和WT植物的疾病指数。

作者又通过烟草叶子中进行了LUC(萤火虫荧光素酶)剪接报告系统分析，以确定GauSR45a如何调节免疫相关基因的剪接。在此测定系统中，报告构建体的外显子跳跃允许LUC蛋白的表达，而内含子保留会产生过早终止密码子，因此无法表达LUC蛋白。另一种是GauBAK1、GauRLK4、GauCERK1、GauWAKs14、GauLRR3和GauPRL基因前体mRNA中的剪接区域与LUC基因融合，并与本塞姆氏烟草叶细胞中的GauSR45a共表达。只有在GauSR45a存在的情况下，才能检测到强烈的发光信号和荧光素酶活性，表明GauSR45a增强了6个免疫相关基因内含子的剪接。在这些基因中，GauBAK1和GauRLK4表现出比其他剪接构建体更强的剪接效率(图4a-c)。为了测试GauSR45a驱动的BAK1外显子跳跃是否有助于VW抗性，在拟南芥中过表达BAK1的两个剪接变体(BAK1.1和BAK1.2)，发现BAK1.1的过表达比BAK1.2赋予更强的VW抗性拟南芥。这些结果表明，GauSR45a可能通过促进高性能免疫相关基因的功能性转录变体的产生来增强对Vd的抵抗力。

图4. SR45a作为剪接调节因子促进棉花防御相关基因的外显子跳跃。(a)基因剪接报告系统的示意图。(b) SR45a参与促进BAK1、RLK4、CERK1、WAKs14、LRR3和PRL的外显子跳跃。(c)转染后48小时从浸润位点收集叶盘，并检测LUC活性(n=9)。

为了探索不同抗性棉花品种对Vd的响应，我们进一步研究了表现出中等抗性和易感抗性的海岛棉Hai7124和陆地棉TM-1基因组中响应Vd诱导的AS事件。结果表明，在没有亚基因组偏好的情况下，对VW具有不同耐受性的棉种之间，响应Vd诱导的AS调节是不同的。进一步使用公共转录组数据来比较海岛棉和陆地棉的全基因组AS事件。与测序数据一致，结果表明，海岛棉基因组在Vd诱导期间调节了更广泛的全基因组AS(图6a)，同时，海岛棉中出现的DASG比陆地棉多得多(图6a)。这种现象可能归因于四倍体物种形成后的种间分化。

通过BLAST、GO富集分析并进一步研究了130个重测序的陆地棉基因组和70个重测序的海岛棉基因组中含有GAAGA的基因的序列变异，结果表明这些基因的GAAGA序列在海岛棉和海岛棉的自然群体中都是保守的。综合表明含有GAAGA的基因在Vd诱导期间在陆地棉和海岛棉中普遍存在并受到AS的差异调节。

图5.陆地棉和海岛棉免疫反应中基因组AS的差异。(a)陆地棉的A和D亚基因组中的AS事件。TM-1通过Vd感应。(b)海岛棉A和D亚基因组中的AS事件。Hai7124由Vd感应。(c) Vd诱导后TM-1中差异表达的AS事件的数量。(d) Vd诱导后Hai7124中差异表达的AS事件的数量。(e) TM-1的A和D亚基因组中差异表达的AS基因的比例。(f) Hai7124的A和D亚基因组中差异表达的AS基因的比例。(g) Vd诱导后Hai7124的A和D亚基因组中差异AS事件的数量。

图6.陆地棉免疫相关DASG的同源基因中没有GAAGA基序。(a)公开转录组数据中海岛棉和陆地棉之间Vd诱导的DASG数量。(b) Vd感染期间差异选择性剪接基因中富集基序的序列标识。(c) Hai7124中Vd诱导的含有GAAGA基序的DASG的比例和TM-1中含有GAAGA基序的同源基因的比例。(d) Hai7124特异的含有基序的基因的GO富集分析

为了剖析GauSR45a的分子机制，作者通过酵母双杂交(Y2H)测定将GauU1-70K和GauU2AF35B鉴定为可能与GauSR45a-L1和GauSR45a-L2相互作用的蛋白质。并通过双分子荧光互补(BiFC)、Pull-down实验、免疫共沉淀(Co-IP)、分裂荧光素酶(LUC)测定等实验均支持GauSR45a-L2/L1和GauU1-70K或GauU2AF35B之间的相互作用。

为了表征GauSR45a与GauU1-70K或GauU2AF35B之间的相互作用，创制了五个GauSR45a变体用于蛋白质相互作用测定。Y2H分析表明GauU1-70K与酵母细胞中GauSR45a的RS2结构域发生物理相互作用。Pull-down和Co-IP测定显示GauSR45aDRS1和GauSR45aRS2均与GauU170K和GauU2AF35B相互作用。这些结果表明RS2结构域对于GauSR45a与GauU1-70K和GauU2AF35B相互作用是必不可少的。

鉴于这些互作结果，接下来研究了GauU2AF35B和GauU1-70K如何参与调节GauSR45a结合mRNA的剪接。RNA-EMSA显示，在存在GauU2AF35B(图7a)或GauU170K(图7b)的情况下，GauSR45a与GauBAK1^5'-GAAGA-3'探针的结合显著增加，但它们都不直接与mRNA探针结合。RNA亲和力测定证实GauU2AF35B或GauU1-70K增强了GauSR45a与GauBAK1mRNA的结合(图7c，d)，但它们不影响GauSR45aDRS2与GauBAK1mRNA的结合(图7c，d)。这些结果表明，GauU2AF35B和GauU1-70K通过增强GauSR45a与GauBAK1 mRNA的结合亲和力，参与GauSR45a介导的GauBAK1的mRNA剪接。

进一步使用RIP-qPCR调查了GauSR45a是否结合到GauRLK4、GauCERK1、GauWAKs14、GauLRR3和GauPRL的RNA。结果显示GauSR45a也结合到这些基因中包含5’-GAAGA-3’基序的区域。此外，发现沉默GauU2AF35B或GauU1-70K基因显著降低了GauBAK1的剪接率(图7f)。这些数据表明，GauSR45a与GAAGA基序结合，并与GauU2AF35B或GauU1-70K相互作用，协调调节免疫相关基因的前体mRNA剪接，以防御Vd感染。

图7. SR45a与U2AF35B或U1-70K通过结合其GAAGA基序来调节BAK1前体mRNA剪接。(a) SR45a直接结合RNA-EMSA中BAK1mRNA的5’-GAAGA-3’基序。(b) RNA-EMSA证实SR45a与BAK1mRNA的5’-GAAGA-3’基序直接结合。(c) RNA-SR45a-U2AF35B亲和力测定。(d) RNA-SR45a-U1-70K亲和力测定。(e)通过RIP-qPCR证实SR45a-GFP与BAK1mRNA的5’-GAAGA-3’基序的结合。IgG作为阴性对照。(f) BAK1剪接比的改变部分依赖于U1-70K或U2AF35B，通过VIGS-U1-70K或-U2AF35B和对照植物中的qRT-PCR测定得到证实。

=== 总结 ===

图8. SR45a与U2AF35B或U1-70K关联的拟议模型，通过结合其GAAGA基序来调节免疫相关的前体mRNA剪接。为了响应Vd入侵，SR45a充当剪接调节因子，与5’-GAAGA-3’基序结合，促进免疫相关基因剪接。SR45a与U2AF35B或U1-70K之间的相互作用增强SR45a与免疫相关基因前体mRNA的结合，从而促进外显子跳跃产生全长功能蛋白并产生抗病性。相反，免疫相关基因前体mRNA的内含子保留会产生截短的蛋白质，最终导致疾病易感性。

原文链接（点击“阅读原文”）

～ The End! ～