2022年8月，西北农林科技大学园艺学院徐凌飞老师团队在杂志International Journal of Molecular Sciences上发表了题为PbXND1 Results in a Xylem-Deficient Dwarf Phenotype through Interaction with PbTCP4 in Pear (Pyrus bretschneideri Rehd.) 的研究论文。通过对PbXND1的剖析，确定了PbXND1的作用机制，为梨矮化品种和矮化砧木的选育提供了重要的参考价值。![]()
株高是果树育种中最重要的目标性状之一。梨因其较高的经济价值而在世界范围内广泛种植。但矮化品种和矮化砧木的缺乏严重制约了梨的集约化栽培。而植物激素与木质部发育对于果树的矮化有重要的影响。木质部发育是影响株高的重要因素，而次生细胞壁的合成和沉积是木质部形成所必需的。XND1作为次生壁形成和程序性细胞死亡的负调节因子，在木质部分化过程中高度表达。对于植株矮化有重要的影响，因此作者通过研究PbXND1的作用机制，为木质部缺陷矮化表型提供了新的理论支持。![]()
# 思维导图
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1.PbXND1与木质部发育密切相关
作者首先通过比较‘红早酥梨’矮化杂交苗与正常杂交苗的株高、木质部宽度及木质素含量，发现在矮化杂交幼苗中，木质部发育的一些正调节因子的表达水平降低，而负调节因子PbXND1的表达水平增加 (图1A-D)。然后在矮化杂交苗中克隆了PbXND1的编码序列，并分析了PbXND1在梨不同发育阶段的根、茎和叶中的表达水平。结果发现PbXND1的表达水平随着植物组织的成熟和木质化而增加 (图1E)。通过GUS染色发现PbXND1主要在维管组织中表达 (图1F)。这些结果表明PbXND1可能参与矮化杂交苗木质部缺陷的矮化表型。![]()
图1. PbXND1与木质部发育密切相关。
(A-D) 矮化/标准杂交苗表型、间苯三酚染色、株高、木质部宽度统计及子代木质部相关基因表达。(E) PbXND1在不同组织中表达水平。(F) PbXND1启动子GUS染色。
2.PbXND1抑制梨的木质部发育
为了验证了PbXND1的功能，作者创制了梨的转基因品系 (图2A)。为了了解PbXND1影响茎生长的机制，在石蜡切片中观察了1月龄的梨茎的结构变化。PbXND1过表达破坏了茎分生组织活性，导致植株高度、导管大小和次生木质部宽度减小，而PbXND1沉默显著增加了梨的木质部宽度，但减小了导管大小 (图2B-E)。为了探索木质部的变化机制，作者测量了转基因梨中木质部的三个主要成分。与野生型相比，PbXND1过表达株系中的木质素、纤维素和半纤维素含量显著降低，但在PbXND1-RNAi株系中的含量显著增加 (图2F-H)。显微镜下观察到PbXND1过表达植物的木质部宽度和导管大小减小 (图2I-L)。以上结果表明，PbXND1过表达导致木质部缺陷，引起植株矮化。![]()
图2. PbXND1抑制转基因梨的木质部发育。
(A-L) 1月龄PbXND1过表达和沉默的梨植株和对照植株生长表型和绿色荧光检测 (A)，株高 (B)，番红O-固绿染色 (C)，木质部宽度 (D)，导管大小 (E)，木质素 (F)，纤维素 (G) 和半纤维素含量 (H)，根中的GFP信号和横切面观察 (I)，PbXND1在转基因梨根中的相对表达 (J)，梨根的木质部宽度 (K) 导管大小 (L)。
3.PbTCP4和PbXND1蛋白之间存在相互作用
为了解PbXND1的作用机制，作者使用梨的酵母文库筛选了与PbXND1相互作用的蛋白。筛选并获得PbTCP4作为候选PbXND1互作蛋白。并通过酵母双杂交实验 (Y2H)，验证了PbXND1和PbTCP4之间的相互作用 (图3A)。然后又通过双分子荧光互补 (BiFC) 进一步验证了两者之间相互作用 (图3B)。![]()
图3. PbTCP4和PbXND1蛋白互作。
(A) 用酵母双杂交方法验证了PbXND1与PbTCP4之间的相互作用，(B) 双分子荧光互补实验 。
4 . PbTCP4促进了梨树根中木质部发育
为了进一步验证PbXND1和PbTCP4的作用机制，作者分析了PbTCP4在梨树不同发育阶段中的表达水平。结果表明PbTCP4在叶中的表达量最高，其次是茎，在根中表达量最低。PbTCP4的表达水平随着植物组织的成熟和木质化而增加 (图4A)。此外，通过GUS染色发现，PbTCP4主要在维管组织中表达 (图4B)。为验证PbTCP4在梨中的功能，获得了过表达与RNAi植株。通过番红O-固绿染色发现过表达转基因株系根部的PbTCP4表达水平增加，而RNAi株系根部的PbTCP4表达水平下降 (图4D)。为了进一步研究PbTCP4是否参与木质部调控网络，作者首先通过石蜡切片以观察木质部发育 (图4E)。过表达PbTCP4显著增加了木质部宽度，但不影响转基因梨根中的导管大小。然而，与野生型相比，PbTCP4沉默减少了木质部宽度和导管大小 (图4F，G)。然后，通过测定根中木质部相关成分的含量发现，PbTCP4过表达显著增加了过表达植物根中木质素、纤维素和半纤维素的含量，而在RNAi植物根中发现相反的情况 (图4H-J)。因此，PbTCP4作为正调节因子，促进了梨木质部的形成。![]()
图4. PbTCP4促进了梨树根中木质部发育
(A) PbTCP4在不同组织和发育阶段的表达水平。(B) PbTCP4启动子的活性。(C) 两月龄PbTCP4过表达和沉默梨根的生长表型和绿色荧光检测。(D) 番红O-固绿染色梨根。(E) PbTCP4在转基因梨根中的相对表达。(F) 梨根的木质部宽度比较。(G) 导管大小。(H–J) 根中的木质素、纤维素和半纤维素含量。
5. PbXND1可以抑制PbTCP4的转录活性
为了研究PbXND1和PbTCP4如何调节梨的木质部发育，对转基因梨中与木质部发育相关的基因进行了定量分析，包括木质素和纤维素生物合成基因和转录因子。PbXND1过表达显著降低了除PbNST1之外的木质部相关基因的表达水平。然而，PbXND1沉默促进了一些木质部相关基因的表达 (图S5A)。PbTCP4与之相反 (图S5B)。在这些木质部相关基因中，次生壁NAC (SWN) 基因是木质部形成的主要调节因子，位于MYB转录因子和木质部相关功能基因的上游。在这项研究中，转基因梨中一种次生壁NAC基因PbVND7的表达水平响应PbXND1和PbTCP4的表达而发生不同的转变。PbTCP4激活PbVND7的表达，而PbXND1抑制PbVND7的表达。因此，作者假设PbXND1和PbTCP4参与PbVND7介导的木质部调节网络。为了进一步了解PbXND1和PbTCP4如何参与PbVND7介导的木质部调节网络，作者通过酵母单杂交 (Y1H) (图5A) 和双荧光素酶实验 (图5B) 进行分析。结果表明PbXND1通过蛋白质互作充当PbTCP4的转录抑制因子。通过亚细胞定位发现PbXND1定位于细胞核和细胞质，PbTCP4定位于细胞核，共定位分析表明PbXND1和PbTCP4位于细胞核和细胞质中 (图5C)。这些结果表明PbXND1通过影响PbTCP4在细胞核中的定位来抑制PbTCP4的转录活性。PbXND1严重抑制PbTCP4的功能，但PbXND1表达仅导致少量PbTCP4隔离在细胞质中。因此，细胞质隔离可能不是PbTCP4功能障碍的主要原因。为了探索其他PbXND1和PbTCP4的作用机制，作者通过EMSA进行分析，当PbXND1与PbTCP4一起孵育时，通过凝胶电泳发现，PbTCP4 DNA结合受到损害 (图5D)。因此，作者得出结论，PbXND1主要通过竞争靶DNA结合位点来抑制PbTCP4的功能。![]()
图S5. PbXND1 (A) 和PbTCP4 (B) 转基因植株中木质部相关基因的表达水平。
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图5. PbXND1可以抑制PbTCP4的转录活性。
(A) 酵母单杂交 (Y1H)，(B) 双荧光素酶 (LUC)，(C) 亚细胞定位和共定位，(D) EMSA。
6. 在PbXND1过表达的梨根中过表达PbTCP4会恢复木质部发育
为了进一步剖析PbXND1和PbTCP4在木质部发育中的关系，作者创制了 PbXND1和PbTCP4共表达梨根。通过观察发现转基因株系木质部表型和导管大小与野生型没有区别 (图6B-D)。与野生型相比，共表达梨根中PbXND1和PbTCP4表达水平增加。而PbVND7的表达水平与野生型相似 (图6E-G)。因此，共表达梨根与野生型木质部表型相似表明PbXND1和PbTCP4之间对木质部的拮抗作用。![]()
图6. 在PbXND1过表达的梨根中过表达PbTCP4，木质部发育得以恢复。
(A-G) WT、PbXND1-OX、PbTCP4-OX 和共表达根 (PbXND1-OX+PbTCP4-OX) 的荧光检测 (A)，横切面观察 (B)，木质部宽度 (C)，PbTCP4、PbXND1和PbVND7在转基因梨根中的相对表达 (E-G) 。
PbXND1与PbTCP4相互作用来协调梨的木质部发育。PbXND1过表达抑制了梨的木质部发育并降低了株高，相反，PbTCP4则促进了梨的木质部发育。PbTCP4直接激活PbVND7的表达。PbXND1通过蛋白互作充当PbTCP4的转录抑制因子，影响梨树木质部发育与株高。
期刊：International Journal of Molecular Sciences
投稿日期：2022.10.13
接收日期：2023.5.15
发表日期：2023.5.29
评述：高贺升
校对：谷子琪
编辑：李敏慧
原文链接（点击“阅读原文”）
