2023年8月，中国林业科学研究院林木遗传育种全国重点实验室李全梓/闫晓婧课题组在JIPB杂志在线发表了题为“PagMYB128 regulates secondary cell wall formation by direct activation of cell-wall biosynthetic genes during wood formation in poplar”的研究论文。该研究发现转录因子PagMYB128是杨树木材形成过程中木质素、纤维素和半纤维素生物合成的正调节因子，与其拟南芥直系同源基因AtMYB103相比，它在木质部细胞次生壁生物合成过程中具有更广泛的调控作用。![]()
木材是重要的工业原材料和可再生资源，广泛用于建筑、家具和制浆造纸等。木质部次生细胞壁(SCW)的厚度和化学组成决定木材的材性。木质素、纤维素和半纤维素是植物次生壁的重要组成成分，已有研究构建了它们生物合成的多层级转录调控网络，该网络中包括一些杨树和拟南芥共有的直系同源转录因子(TFs)。在杨树中，已经确定了许多在木材形成过程中调节SCW生物合成的TFs，这些TFs在调节拟南芥和杨树间SCW的生物合成中具有保守功能。然而，这些TFs在拟南芥和杨树之间的调节机制的具体差异仍然知之甚少。![]()
# 思维导图
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1.PagMYB128调控杨树SCW的形成
为了研究PagMYB128在杨树SCW形成中的作用，作者构建了PagMYB128-OE超表达转基因株系和PagMYB128:SRDX显性抑制转基因株系，作者通过RT-qPCR测定了PagMYB128在转基因植株的4个品系中的表达水平(图1D)。表型观察发现，与野生型(WT)植物相比，PagMYB128-OE株系的生长速度加快，而PagMYB128-SRDX株系的生长速度减慢(图1A，B)；PagMYB128-OE株系的地径增粗，而PagMYB128-SRDX株系地径变细(图1C)；切片观察PagMYB128-OE株系第10节间的木质部宽度增加，而PagMYB128-SRDX株系木质部宽度变窄(图1E)，统计分析结果表明木质部宽度和纤维细胞数量的变化是显著的(图1F，G)，这与转基因植株茎粗的变化一致。扫描电镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察茎横切面发现，与野生型相比，过表达植株木质部次生细胞壁变宽，分化木质部细胞数目增多，纤维细胞和导管次生壁变厚，木质化程度加深，木材中的木质素、纤维素和半纤维素的含量增加，木质素S/G比值增加，而显性抑制转基因杨树则呈现相反的表型。![]()
图1. PagMYB128-OE和PagMYB128-SRDX转基因杨树表型。(A)WT、PagMYB128 OE(OE‐4、OE‐5)和PagMYB128:SRDX OE转基因株系(SRDX‐1、SRDX‐3)。(B)株高。(C)地径。(D)PagMYB128基因在WT和4个转基因系中的RT-qPCR分析。(E)3个月龄的WT，OE-4，OE-5，SRDX-1和SRDX-3第10节间茎横切面。(F-G)OE-4、OE-5、SRDX-1和SRDX-3第10节间茎横切面木质部宽度及统计分析。
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图2. 扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察。WT(A，F)、PagMYB128‐OE株系OE‐4 (B，G)、OE‐5 (C，H)、PagMYB128‐SRDX株系SRDX‐1 (D，I)和SRDX‐3 (E，J)茎横切面的SEM观察，(F-J) (A-E)放大图像。
2.PagMYB128调控细胞壁代谢产物基因的表达
为了验证与纤维素、半纤维素和木质素生物合成的细胞壁生物合成有关基因的表达是否受到PagMYB128的调控，作者对WT和PagMYB128‐OE转基因植株进行了高通量RNA测序，RNA‐seq分析鉴定出转基因植物中39286个差异表达基因(DEG)以及纤维素、木质素和半纤维素生物合成途径酶基因在DEG中的表达，编码这五种纤维素合成酶的PagCesA4、CesA7‐A/B、A和CesA8‐A/B在PagMYB128‐OE转基因植物的分化木质部中表达上调(图3A)。在单脂醇生物合成的11个生物合成酶家族中，编码6个家族的8个基因表达上调，分别为Pag4CL3、C4H2、C3H3、HCT6、PAL2/4和CAld5H1/2(图3B)，作者还观察到，大多数参与木聚糖生物合成的酶在PagMYB128-OE转基因植物中都表达上调(图3C)。作者还选择了PagCesA4、CesA8-A/B、PAL1、PAL2、PAL3、4CL3、C4H1/2、C3H3、CCoAOMT1/3、CCR2、CAD1、FRA8、GT43A/B、GT8D2、GUX1A、GXM2/3、IRX10-1/2、PARVUS1/2和PARVUS-L1等26个基因进行RT‐qPCR分析(图3D，E)，发现他们在PagMYB128-OE转基因植株的分化木质部中表达上调，而在PagMYB128-SRDX转基因植株中表达下调。RT-qPCR分析结果与RNA-seq分析结果一致，两项分析均表明PagMYB128过表达上调了纤维素、木质素和木聚糖生物合成的生物合成酶基因，说明PagMYB128促进SCW形成。![]()
图3.PagMYB128的变化影响了纤维素、木质素和木聚糖生物合成途径酶基因的表达。(A-C)PagMYB128干扰影响了纤维素、木质素和木聚糖生物合成途径酶基因的表达。(D-E) PagMYB128‐OE和PagMYB128‐SRDX转基因植物和野生型(WT)分化木质部中纤维素、木质素和木聚糖生物合成必需酶编码基因的RT-qPCR分析。
3.PagMYB128直接调控纤维素、木质素和半纤维素的生物合成
作者选择了细胞壁生物合成途径中的11个酶基因(PagCesA4，CesA8‐A/B，PAL2，PAL3，4CL3，C3H3，CCR2，FRA8，GT8D2和GT43B)，为了研究PagMYB128是否可以结合这些基因的启动子来调节纤维素，作者通过ChIP‐qPCR结果表明PagMYB128可以结合8个基因的启动子，包括PagCesA4、CesA8‐A/B、PAL2、PAL3、4CL3、C3H3-A和FRA8(图4C-E)。作者通过酵母单杂交(Y1H)和双荧光素酶报告基因实验（Dual-LUC）进一步对这8个基因对PagMYB128的调控进行验证。Y1H实验说明PagMYB128可以激活这8个基因的启动子，Dual-LUC实验显示共转化中的LUC活性都增加(图4H-J)，表明PagMYB128的瞬时过表达会影响每个启动子的活性。Y1H和Dual-LUC均支持ChIP‐qPCR结果，表明PagMYB128直接调控了参与纤维素、木质素和半纤维素生物合成的基因。![]()
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图4.PagMYB128直接结合纤维素、木质素和木聚糖生物合成酶基因的启动子。(A)瞬时过表达植物中PagMYB128:FLAG融合蛋白的Western blotting检测。(B)次级细胞壁(SCW)基因启动子图。(C-E)纤维素途径、木质素途径和半纤维素途径的ChIP‐qPCR分析。(F-G)酵母单杂交试验。(H)效应报告试验。(I)双荧光素酶报告基因实验。(J)四个位置的agro浸润构建体的组合。
4.PagMYB128通过直接激活PagCAld5H1/2调控S-单脂醇生物合成
PagCAld5H1和PagCAld5H2是两个冗余催化S-单醇(sinapyl醇)生物合成的关键酶，基因表达分析显示，PagCAld5H1/2在PagMYB128-OE植株的分化木质部中表达上调(图3B)。间苯三酚-盐酸染色显示PagMYB128-OE株系的木质部粉红色更深(图5)，表明OE株系的木质素化程度增强，SRDX株系木质素化程度降低，这与转基因植株木质素含量的变化一致(表1)，Mäule染色显示SRDX株系的红色较浅(图5)，这说明木质化降低了S-单分子醇水平。作者通过对WT和转基因木材中的纤维素水解酶木质素进行HSQC核磁共振(NMR)分析后发现WT和转基因的木质素结构没有明显差异(图6)，OE‐4和OE‐5中，PagMYB128‐OE株系的木质素S/G比高于WT，而在PagMYB128‐SRDX株系中木质素S/G比低于WT。PagCAld5H1和PagCAld5H2在PagMYB128‐OE植株的分化木质部中表达上调，在PagMYB128‐SRDX植株的分化木质部中表达下调，这说明PagMYB128可以正调控这两个基因的表达并参与S‐单脂醇生物合成。随后作者通过酵母单杂试验验证PagMYB128可以直接调控PagCAld5H1/2，ChIP‐qPCR结果显示PagMYB128可以结合PagCAld5H1和CAld5H2的启动子(图7B)。作者进一步通过Dual-LUC证明PagMYB128的过表达可以激活烟草细胞中PagCAld5H1/2的启动子活性(图7C-F)。![]()
图5.野生型(WT)和转基因株系茎段横切面的木质素含量和组成。(A)间苯三酚‐盐酸染色。(B)Mäule染色。
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图6. HSQC核磁共振显示的PagMYB128 OE和SRDX转基因植物中酶木质素的芳香结构。
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图7. PagMYB128直接结合PagCAld5H1/2。(A)酵母单杂交试验的启动子。(B)ChIP-qPCR测定。(C-F)荧光素酶报告基因实验。
5.PagSND1直接调控PagMYB128，但不调控细胞壁代谢基因
为了研究PagSND1s是否对杨树PagMYB128有直接的调控作用，作者进行了Dual-LUC试验。当四个PagSND1基因在烟草叶片中转化时，协同转化的PagMYB128启动子可以被激活(图8A-C)。通过ChIP‐qPCR和Y1H分析表明PagMYB128是4个PagSND1s的直接靶点之一。ChIP‐qPCR实验未检测到PagSND1s与PagCesA4、CesA8‐A/B、FRA8、PAL2/3、C3H3、4CL3和CAld5H1/2的启动子结合，说明四个PagSND1s不能直接调节细胞壁生物合成酶的基因。![]()
图8. PagSND1直接结合PagMYB128的启动子。(A-C)Dual-LUC试验。(D)酵母单杂交试验。(E)ChIP-qPCR测定。
拟南芥中AtSND1蛋白可直接结合AtMYB103启动子，AtMYB103突变可影响木质素和纤维素生物合成相关基因AtF5H1、AtCesA4、AtCesA7、AtCesA8的表达水平，但没有证据表明两者之间存在直接的相互作用关系。此外，AtMYB103可以直接与ATTBL27相互作用，调节半纤维素的生物合成。RNA-seq和RT-qPCR结果表明在杨树中，PagSND1蛋白与PagMYB128启动子结合，PagMYB128可以与木质素生物合成酶基因(PagPAL2/3、PagC3H3、Pag4CL3和PagCAld5H1/2)、纤维素合成酶基因(PagCesA4、PagCesA8-A和PagCesA8-B)和木聚糖生物合成酶基因(PagFRA8)的启动子结合，促进次生壁形成。结果表明，SND1-MYB128途径是激活次生细胞壁(SCW)生物合成的有效途径。研究结果丰富了木材形成的转录因子调控网络，为利用生物育种技术创制优异林木新品种提供理论基础和基因资源。![]()
图9. 拟南芥AtMYB103与杨树PagMYB128调控网络对比图。
期刊：Journal of Integrative Plant Biology
投稿日期：2024.2.14
接收日期：2024.5.8
发表日期：2024.6.21
评述：吴姿锐
校对/编辑：吴凤霞
原文链接（点击“阅读原文”）
