Plant Commun 长文综述 | RNA m6A修饰与表观遗传因子在植物基因调控中的相互作用

摘要：N⁶-甲基腺苷（N⁶-methyladenosine，m⁶A）是在真核生物mRNA中最丰富的修饰。随着转录组范围内m⁶A定位和测序技术的发展，一些保守的基序已在植物中得以鉴定，包括RRACH（R = A/G和H = A/C/U）和UGUAW（W = U或A）基序。然而，m⁶A标记在每个转录本中保守基序的特定位置的沉积机制仍需澄清。植物和动物研究的证据表明，m⁶A的写入或擦除组件通过与特定的转录因子、5mC DNA甲基化标记和组蛋白标记相互作用而被招募到特定的基因组位点。此外，最近在动物细胞中的研究表明，microRNA通过碱基配对机制在转录物的特定位点中积累m⁶A修饰。此外，m⁶A还影响调控染色质相关RNAs和长非编码RNAs的生成和功能。尽管我们对植物m⁶A修饰与表观遗传因子之间联系的理解不如对动物的了解多，但最近在鉴定与m⁶A写入或擦除组分相互作用的蛋白质方面的进展扩大了对m⁶A修饰与表观遗传因子之间关系的了解，这些表观遗传因子在植物m⁶A的转录特异性甲基化和调控中起着关键作用。

关键词：RNA甲基化，DNA甲基化，组蛋白修饰，表观遗传学，微小RNA，长非编码RNA。

目前，已经在RNA中鉴定出超过160种化学修饰，包括mRNA、rRNA、tRNA、小RNA（miRNA）和长非编码RNA（lncRNA），其中N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是在真核mRNA中发现的最丰富的修饰。自从首次报道拟南芥（Arabidopsis thaliana）中mRNA m⁶A甲基化组以来，m⁶A在转录组范围内的分布已在许多其它植物物种中揭示。在植物细胞中大约50 - 60%的转录物是m⁶A修饰的，大多数只有一个甲基化修饰，其次是2 - 4个修饰。值得注意的是，m⁶A修饰主要在植物和动物的终止密码子附近和3-非翻译区（UTR）中出现。m⁶A标记分别由甲基转移酶、去甲基化酶和RNA结合蛋白添加、去除和识别。已经确定的或潜在的m⁶A写入器（writers）、擦除器（erasers）和读取器（readers）总结于表1中，并简要描述如下。

m⁶A writers：已经在植物中鉴定了两种类型的写入器：由甲基转移酶A（MTA）、MTB、VIRILIZER（VIR）、泛素E3连接酶（HAKAI）、FKBP 12相互作用蛋白37（FIP 37）和HAKAI相互作用锌指蛋白2（HIZ2）组成的m⁶A写入复合物和独立的甲基转移酶FIONA 1。mRNA中m⁶A甲基化组的全转录组分析显示，所述写入复合物将m⁶A优先添加在（A/G）（A/G）AC（A/C/U）和UGUA（A/C）序列基序内（其中下划线的A是甲基化位点）。此外，FIONA 1将m⁶A添加到包含UACAGAGA基序的发夹形RNA上（下划线的A是甲基化位点）。mRNA上的这些甲基转移酶介导的m⁶A修饰在植物的胚胎发生、减数分裂、种子萌发、叶片发育、毛状体形态、果实成熟、衰老、非生物胁迫应答和免疫中起着至关重要的作用。

m⁶A erasers：已经提出α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同系物（ALKBH）蛋白质作为负责m⁶A标记的去甲基化擦除器。自从发现ALKBH5和脂肪量及肥胖相关蛋白（FTO）在人体中作为m⁶A去甲基酶以来，几个ALKBH家族成员已在植物中被证明是m⁶A擦除器。拟南芥中的ALKBH8B、ALKBH9B、ALKBH9C和ALKBH10B，番茄中的ALKBH2和ALKBH10B、水稻中的ALKBH9和棉花中的ALKBH10已被证实或提出为m⁶A擦除器，其在叶片发育、花型转变、雄性育性、果实成熟、非生物胁迫或脱落酸应答和病毒防御中起关键作用。擦除器介导的m⁶A修饰主要通过影响mRNA稳定性和mRNA沉默来发挥其功能。

m⁶A readers：已经在哺乳动物细胞中使用基于质谱的筛选鉴定了潜在的m⁶A结合蛋白，包括YT521-B同源性（YTH）结构域蛋白、K同源性（KH）蛋白、CCHC锌指蛋白、RNA识别基序蛋白和锌指蛋白。其中，YTH-结构域蛋白，也称为进化保守的C-末端区（ECT），被定为m⁶A读取器。拟南芥属基因组编码13个含YTH结构域的蛋白质，其中ECT1、ECT2、ECT3、ECT4、ECT8、ECT9、ECT12和CPSF30-L的功能已在叶和毛状体发育、器官发生、硝酸盐信号传导、非生物或生物胁迫响应和ABA响应中得到证实。此外，最近的研究表明开花基因座K，一种KH结构域蛋白，是一种调节拟南芥花转变的新的mRNA m⁶A读取器。另外，含有YTH结构域的RNA结合蛋白2（YTP2）显示出赋予苹果白粉病抗性，并且YTP8和YTP9显示参与番茄的低温和水涝胁迫响应。值得注意的是，YTH07与早抽穗期6相互作用并促进水稻开花。阅读器介导的m⁶A解释对于植物发育、花型转变、非生物和生物胁迫应答以及通过调节mRNA的命运的ABA应答是关键的：例如，ECT1、ECT8和YTH07经历相分离，ECT2/3/4/12影响mRNA稳定性，控制聚腺苷酸化的CPSF30-L影响mRNA稳定性和剪接的FLK，以及YTP2调节mRNA稳定性和翻译效率。

值得注意的是，随着对转录组范围内m⁶A分布和与上述m⁶A写入、擦除和读取相关的细胞组分的理解增加，最近的研究表明，RNA m⁶A甲基化与表观遗传调节因子密切相关，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA、长非编码RNA和染色质重塑（表2）。尽管我们对植物中m⁶A修饰和表观遗传因子之间的联系的了解远远落后于动物中的知识，但最近在鉴定与m⁶A写入或擦除组分相互作用的蛋白质方面的进展扩大了对植物中m⁶A修饰和表观遗传因子之间的串扰的了解。最近的一篇综述文章强调了植物表位转录组与DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的一些潜在联系。在下面的章节中，我们将首先讨论一些关于RNA m⁶A修饰与动物表观遗传调节因子之间关系的重要发现，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、microRNAs、长非编码RNAs和染色质重塑。然后重点介绍了最近在植物中发现的最新知识，并提出了未来可能的研究，以进一步了解m⁶A修饰和表观遗传因子之间的串扰在植物中的作用。

表2.不同植物物种中RNA m⁶A甲基化与表观遗传调节因子之间的相互作用。

DNA甲基化是与维持和调节基因组稳定性相关的保守表观遗传标记，从而影响植物发育和胁迫反应期间的基因表达。在植物中，通过RNA指导的DNA甲基化（RdDM）途径介导从头DNA甲基化，其中DNA甲基转移酶结构域重排甲基化酶2（DRM2）和RNA指导的DNA甲基化3（RDM）负责DNA甲基化。此外，DNA甲基化的维持是由甲基转移酶1（MET1）和DNA甲基转移酶色甲基化酶2/3（CMT2/3）催化的。相反，DNA去甲基酶可以消除DNA上的甲基化标记。在植物中，几种酶，包括沉默抑制子1（ROS1）、DEMETER（DME）和DEMETER样蛋白2/3（DML2/3），负责DNA去甲基化。这些DNA甲基转移酶和去甲基化酶调节5mC修饰的分布，5mC修饰在植物的发育和胁迫响应中起着至关重要的作用。

在动物中广泛研究了RNA m⁶A甲基化和表观遗传调节因子之间的密切相互作用。在胰腺癌中，DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3a与METTL3的启动子（m⁶A写入复合物的核心成分）的结合导致METTL3的下调。在食管鳞状细胞癌中，ALKBH5 CpG岛的低甲基化增加了ALKBH5转录水平，导致m⁶A丰度降低。人胎儿组织的m⁶A谱显示m⁶A优先结合在能够调节m⁶A水平的富含CpG的启动子上。最近对泛癌基因组的生物信息学分析证明了在33种癌症物种中5mC和m⁶A调节子之间的全面相互作用。这些结果提示m⁶A生物合成和DNA甲基化的共转录过程。

在植物中，先前的研究表明DNA甲基化调节RNA去甲基化酶SlALKBH2的表达，然后影响m⁶A甲基化和DNA去甲基化酶SlDML2的表达，从而通过反馈环影响DNA甲基化，最终调节果实成熟（图1）。然而，与番茄不同，涉及m⁶A脱甲基酶SlALKBH2作为DNA脱甲基酶的有效调节剂的跃变型果实，草莓（Fragaria vesca），一种非跃变型水果，在m⁶A修饰和参与RdDM途径的DNA甲基转移酶的调节之间没有表现出相关性。最近的研究报道了在玉米（Zea mays）籽粒发育过程中m⁶A和5mC之间的串扰。有趣的是，ZmMTA和ZmDDM1，调节DNA甲基化的关键染色质重塑因子，一起相互作用以协调m⁶A修饰和5mC甲基化，这对于胚胎发生和胚乳发育是必需的。总之，这些研究清楚地证明了m⁶A和5mC在植物发育中的密切联系。此外，近年来许多研究表明，RNA m⁶A修饰与植物DNA甲基化密切相关，这一点将在下文的“展望与未来研究”部分进行重点阐述。

图1.mRNA m⁶A甲基化与DNA甲基化在番茄中的相互作用，m⁶A擦除器SlALKBH2去除了DNA 5mC擦除器SlDML2 mRNA上的m⁶A修饰，以增强其稳定性，导致更高的蛋白水平。反过来，增加的SlDML2引起DNA低甲基化，从而通过正反馈环激活SlALKBH2表达。果实成熟相关基因的全基因组DNA低甲基化导致果实早熟。

mRNA m⁶A和组蛋白修饰之间可能存在两个方向的相互作用：从组蛋白修饰到m⁶A和从m⁶A到组蛋白修饰。目前，mRNA m⁶A和组蛋白修饰之间的密切联系仅在动物中得到证实。作为从组蛋白修饰到mRNA m⁶A甲基化的相互作用的实例，在哺乳动物细胞中，组蛋白H3在赖氨酸36的三甲基化（H3K36me3）被METTL14（m⁶A写入复合物的核心组分）识别并直接结合，METTL14进而促进m⁶A修饰沉积到活性转录的RNA上。在人THP-1细胞中，赖氨酸脱甲基酶6B（KDM6B）招募m⁶A写入复合物，通过在细菌感染期间移除相邻的H3K27me3促进mRNA转录中的m⁶A甲基化。相反，一些研究表明mRNA m⁶A甲基化与组蛋白修饰之间存在相互作用。在胚胎神经干细胞中，m⁶A通过使编码组蛋白修饰酶的转录物不稳定来调节H3K27me3和H3K27ac修饰。在小鼠胚胎干细胞中，m⁶A读取器YTH结构域包含1（YTHDC1）与H3K9me2去甲基化酶KDM3B相互作用，并将其招募至m⁶A相关染色质区域，从而促进H3K9me2去甲基化。在自我更新的体细胞组织中，METTL3促进m⁶A介导的编码H3K4甲基转移酶的mRNA的降解，包括SETD1A、SETD1B、KMT2B和KMT2D。总之，这些结果表明，由m⁶A调控的组蛋白修饰是哺乳动物细胞中一种新的基因调控机制。

在植物中，mRNA m⁶A在组蛋白修饰中的作用，在很大程度上仍然未知。最近的研究已经证明，人m⁶A擦除FTO在水稻和马铃薯中的异位表达通过影响H3K9me2和H3K27me3修饰而增加了植物的产量和生物量。此外，未鉴定的m⁶A读取器可能与转录mRNA上的m⁶A修饰结合，并募集组蛋白修饰酶，导致组蛋白在特定基因组位点发生甲基化或去甲基化（图2B）。鉴于mRNA m⁶A在组蛋白修饰中的作用以及组蛋白修饰与mRNA m⁶A的相互作用在植物中的研究还没有被发现，对mRNA m⁶A在组蛋白修饰突变体中的模式的分析，以及对m⁶A的写入或擦除突变体中的组蛋白修饰模式的研究，保证了未来的研究，以进一步了解mRNA m⁶A与组蛋白修饰之间的相互作用。最近的一项研究揭示组蛋白H3K36me2标记与m⁶A修饰在终止密码子周围和mRNA的3′-UTR中的积累密切相关（图2A）。植物中m⁶A修饰和组蛋白修饰之间的潜在相关性将在下文的“前景和未来研究”部分中强调。

图2. mRNA m⁶A甲基化与组蛋白修饰的相关性(A)在拟南芥中，m⁶A写入复合体优先将m⁶A修饰安装在mRNA的终止密码子周围和3′-UTR中。鉴于H3K36me2在基因的3′端附近富集，推测H3K36me2标记和未鉴定的蛋白质将m⁶A修饰募集到m⁶A位点，导致m⁶A修饰积累在终止密码子周围或转录mRNA的3′-UTR中。(B)未鉴定的m⁶A读取器结合转录mRNA上的m⁶A标记，并募集组蛋白修饰酶，导致组蛋白在特定基因组位点的甲基化或去甲基化。

4.mRNA m⁶A修饰与microRNA的相互调节

MicroRNAs（miRNAs）是一类20 ~ 24个核苷酸的非编码RNA，在基因沉默中起着重要作用。miRNAs的生物发生涉及多步途径，包括初级miRNAs（pri-miRNAs）的产生和随后加工成前体miRNAs（premiRNAs），随后形成成熟miRNAs。近年来，研究发现了两个方向的相互作用：影响miRNA生物合成的m⁶A修饰和调控m⁶A修饰的miRNA。作为将m⁶A修饰与动物中的miRNA生物发生和功能联系起来的一个例子，METTL3介导的m⁶A修饰与pri-miRNA的生物发生、增强其成熟和加工、以及miRNA-AGO2相互作用和miRNA功能错综复杂地联系在一起。此外，m⁶A读取器HNRNPA2B1通过增强DGCR8与pri-miRNA转录物的结合来提高miRNA加工的效率。相反，在动物研究中，miRNAs可能参与了m⁶A修饰。先前的研究表明，大约67%的含有m⁶A位点的3′-UTR具有至少一个miRNA结合位点，并且大约92 - 96%的m⁶A区域与miRNA反向互补，这表明m⁶A残基与miRNA结合位点之间存在关联，并且miRNA在m⁶A形成中具有调节作用。几条证据表明，动物中的miRNA，如miR-66、miR-33a和let-7g，可以靶向METTL3的3′-UTR以抑制其表达，而miR-145通过靶向YTHDF2 3′-UTR而显著增加m⁶A水平。最近的研究已经证明在神经胶质瘤干细胞中，miR-145的异位表达诱导肿瘤抑制基因的RRACH基序中的m⁶A的丢失，而miR-145的抑制维持基因中的m⁶A水平，这表明miRNA也参与m⁶A去甲基化。总之，这些研究表明miRNA在动物m⁶A形成中起关键调节作用。

在植物中，除了Bhat et al.（2020）最近的一份报告证明了m⁶A甲基化对拟南芥中miRNA生物合成的影响外，探索m⁶A修饰与miRNA生物合成之间联系的研究还很缺乏。在本研究中，m⁶A写入者MTA显示甲基化pri-miRNA并影响其加工和成熟，可能通过影响miRNA前体的二级结构和微处理器组分的募集（图3A）。此外，已经证明MTA直接与miRNA生物发生早期阶段中涉及的关键蛋白质如RNA聚合酶II和TOUGH相互作用，这表明pri-miRNA的转录共甲基化。虽然本研究明确指出了m⁶A甲基化在植物miRNA生物合成中的重要作用，但要进一步阐明m⁶A甲基化在miRNA生物合成中的作用机制以及miRNA介导的m⁶A修饰在植物中的作用，仍有几个关键问题需要回答，这些问题将在下文的“展望与未来研究”部分进行讨论。

5.mRNA m⁶A修饰与长链非编码RNA的关系

长链非编码RNAs（lncRNAs）是内源性RNA分子，其功能独立于其蛋白质编码潜力。与编码蛋白质的mRNA相似，lncRNAs也会发生m⁶A修饰，这对lncRNAs的表达和功能至关重要。在哺乳动物中，lncRNAs中的m⁶A修饰显著影响癌症发病机制和药物应答。METTL3介导的m⁶A甲基化影响lncRNAs的稳定性和细胞定位，促进癌症发生。此外，ALKBH5介导的m⁶A去甲基化调节lncRNAs的命运，影响癌细胞的迁移、侵袭和增殖。m⁶A读取器IGF2BP2和YTHDF3与lncRNA中的m⁶A修饰的结合调节其稳定性，影响癌细胞增殖。相反，lncRNAs也调节m⁶A修饰物，影响其功能。LncRNA LINRIS通过抑制泛素化-蛋白酶体途径来稳定IGF2BP2，并且由lncRNA LINC0266 -1编码的71个氨基酸的肽与IGF2BP1相互作用并增强其m⁶A读取器活性。总之，这些研究突出了lncRNAs与m⁶A调节因子之间复杂的相互作用，强调了lncRNAs在调节m⁶A相关通路中的关键作用及其对哺乳动物细胞基因调控的影响。

在植物中，m⁶A在lncRNAs调节中的作用仅在少数情况下被研究。拟南芥中的lncRNA COOLAIR是m⁶A修饰如何在基因调节和开花时间控制中发挥关键作用的主要因子。COOLAIR中的m⁶A修饰增强了其与开花控制基因座A和3′-RNA加工因子FY的相互作用，导致开花基因座C（FLC）表达的阻抑（图4A）。假设m⁶A修饰诱导COOLAIR的构象变化，提高其对相互作用蛋白的亲和力。该研究阐明了m⁶A修饰在调节lncRNA功能、影响稳定性和定位以及蛋白质相互作用的潜力中的新作用。

图4.RNA m⁶A甲基化与长链非编码RNA加工和染色质重塑的相关性(A)在拟南芥中，m⁶A标记基因将m⁶A标记到COOLAIR上，COOLAIR是开花控制基因座C（FLC）的长链非编码反义RNA，引起COOLAIR的构象变化，增强了COOLAIR与开花控制基因座A（FCA）和3′-RNA加工因子FY的相互作用。未鉴定的m⁶A阅读器参与染色质沉默，导致FLC抑制和早期开花。(B)MTA通过一种未知的因子被招募到转录的染色质相关调节RNA（carRNA）中，并在新生转录物上安装m⁶A标记，识别并结合m⁶A修饰的m⁶A读取器募集未鉴定的组蛋白修饰酶，改变组蛋白修饰，其诱导染色质结构从封闭结构变为开放结构，并增强染色质可及性。

6.mRNA m⁶A修饰与染色质可及性的偶联

染色质可及性是指蛋白质与染色DNA的物理接触程度，由核小体的空间构型和密度决定。越来越多的证据表明，染色质可及性也是由染色质相关调节RNAs（carRNAs）决定的，包括启动子相关RNAs（paRNAs）、增强子或超级增强子RNAs（eRNAs / seRNAs）和重复RNAs。有趣的是，最近的动物研究揭示了RNA m⁶A甲基化与染色质可及性之间的复杂关系。在小鼠胚胎干细胞中METTL3介导的m⁶A修饰稳定了carRNAs，导致开放染色质状态，并通过改变组蛋白修饰和转录调节因子的募集增强了转录。此外，约30%的seRNAs被METTL3 m⁶A甲基化，从而允许YTHDC2募集组蛋白甲基转移酶MLL1以诱导H3K4me3修饰并增加染色质可及性。另外，m⁶A去甲基酶FTO通过使LINE1 RNA去甲基化而改变小鼠胚胎干细胞中染色质的可及性，从而影响局部染色质结构和转录。这些观察结果强调了m⁶A RNA甲基化与染色质可及性和基因表达调控之间的调控机制。

证明m⁶A修饰对植物中染色质可及性的影响的研究在很大程度上尚未被探索。在最近的研究中，显示人m⁶A橡皮擦FTO在水稻和马铃薯中的异位表达介导poly（A）RNA中约7%的去甲基化和非核糖体核RNA和重复RNA中m⁶A的35%的减少，促进更开放的染色质状态和转录激活。这些观察结果表明FTO介导的m⁶A去甲基化通过m⁶A修饰的重复RNA或其它carRNAs影响染色质状态。值得注意的是，FTO在水稻和马铃薯中的转基因表达导致产量和生物量增加约50%，表明m⁶A介导的染色质重塑是提高作物产量的有希望的策略。m⁶A修饰在植物中carRNAs介导的染色质重塑中的潜在作用将在下文的“前景和未来研究”部分中强调。

7.植物研究的前景与展望

m⁶A和DNA甲基化：值得注意的是，在盐胁迫下，参与DNA甲基化的基因在拟南芥vir突变体（m⁶A的一种写入组分）中被高度下调和许多表观遗传相关基因，包括DNA甲基化/去甲基化、染色质组织和组蛋白修饰，在苹果（Malus prunifolia）中响应干旱胁迫而高度富集。此外，在低温胁迫下拟南芥mta突变体中，与DNA修饰和组蛋白甲基化相关的基因的翻译效率被下调。这些观察结果表明，m⁶A调节DNA甲基化以响应各种非生物胁迫。最近的几项研究表明，m⁶A机制的表达在多种植物物种中响应非生物胁迫而受到调节，例如，拟南芥中的m⁶A写入器和擦除器响应干旱、盐或ABA；棉花（Gossypium hirsutum）中的m⁶A擦除响应盐和干旱胁迫；m⁶A写入器和擦除器在番茄对干旱、盐、ABA、生长素或赤霉素的响应中起作用；甜高粱（Sorghum bicolor）中的m⁶A写入器和擦除器响应于盐胁迫。此外，许多研究表明，DNA甲基化在植物对非生物胁迫的反应中受到调节。值得注意的是，番茄中的DNA去甲基化酶DML2在低温胁迫下被抑制，增加了DNA的甲基化水平并有助于番茄的耐冷性。在冷胁迫下的白杨（Populus simonii）中，CMT3.1和3.2、DRM2、MET1.1、ROS1以及DME1和3的表达被冷胁迫诱导，维持CHG位点的甲基化。有趣的是，在热胁迫下的白杨中，DRM2、MET1.1和1.3以及DDM1.1的表达上调，而ROS1和DME的表达被热胁迫抑制。在盐胁迫下的拟南芥中，ROS1的表达增加，介导抗氧化剂相关基因的启动子和编码区的去甲基化。这些观察结果提出了一个有趣的问题，即在特定的非生物胁迫下，5mC写入器和擦除器转录物中的m⁶A修饰是否与调节这些DNA甲基化组分相关，以及相关程度如何。显然，需要更多的工作来了解植物表观基因组和表位转录组机制及其反馈回路之间的相互作用，这对胁迫反应以及胚胎发生、开花和果实成熟至关重要。

m⁶A和组蛋白修饰：与H3K36me3直接被METTL14识别和结合的发现相反，METTL14是m⁶A写入复合物的核心成分，其反过来促进m⁶A修饰积累到动物中活性转录的RNA上，最近的一项研究表明，H3K36me2，而不是H3K36me3，在拟南芥中转录mRNA的过程中在积累m⁶A修饰中起作用（图2A）。值得注意的是，H3K36me2在基因的3-末端附近富集。考虑到m⁶A修饰优先结合在植物中mRNA的终止密码子周围和3’-UTR中，很可能是H3K36me2在转录mRNA时将m⁶A写入复合物引导到终止密码子和3’-UTR附近，从而将m⁶A修饰积累在mRNA的终止密码子和3’-UTR附近（图2A）。相反，m⁶A读取器可能与转录mRNA上的m⁶A修饰结合，并募集组蛋白修饰酶，导致特定基因组位点组蛋白的甲基化或去甲基化（图2B）。探索m⁶A和组蛋白修饰之间的双向相互作用是否像在动物中观察到的那样存在于植物中将是有趣的。

m⁶A和miRNAs：为了进一步阐明m⁶A甲基化在植物miRNA生物合成中的作用机制，有几个关键问题尚待回答。1)MTA介导的m⁶A积累如何影响pri-miRNAs的茎环结构？2) m⁶A读取器是否参与识别m⁶A修饰和随后的pri-miRNAs的生物发生？3)在m⁶A擦除突变体中是否观察到类似的m⁶A依赖性miRNA生物合成调节？4)鉴于m⁶A甲基化和miRNA生物合成的模式因细胞和组织类型以及环境刺激而异，在特定环境条件下，m⁶A修饰如何影响植物不同发育阶段的miRNA生物合成？5)是否存在miRNA通过影响m⁶A写入或擦除基因的表达来影响总体m⁶A水平的相互调节过程？此外，如在动物细胞中所揭示的，miRNA是否通过碱基配对机制在植物转录本的特定位点引导m⁶A修饰将是值得探索的（图3B）。这些基本问题仍有待于进一步验证，以进一步了解mRNA m⁶A修饰与植物miRNA之间的相互作用。

m⁶A和lncRNAs以及染色质重塑：尽管缺乏关于lncRNAs上m⁶A修饰在植物中的分布和位置的信息，但是采用修饰的核糖核苷酸（HAMR）流水线的高通量注释的研究已经揭示了影响各种非编码RNAs（包括lncRNAs）的结构和功能动力学的一系列RNA修。这些观察结果表明，m⁶A和其他修饰在决定lncRNAs的结构、相互作用和调控潜力方面起着关键作用。进一步研究m⁶A相关lncRNA信号及其在调控过程中的作用将加深我们对m⁶A修饰与lncRNA之间联系的理解。考虑到paRNAs在拟南芥中广泛存在，carRNAs，包括paRNAs，很可能在控制植物染色质可及性方面发挥着关键作用（图4 B）。值得注意的是，最近开发的称为染色质相关RNA测序（ChAR-seq）的近缘连接和测序方法可以绘制转录组和基因组范围的RNA-DNA接触图，提供染色质结合RNA靶标的鉴定。利用该测序工具对m⁶A写入或擦除突变体进行测序，将揭示carRNAs中的m⁶A修饰是否与处于不同发育阶段的植物以及对不同环境线索作出反应的植物中的染色质打开/关闭相关。

8.突出问题和未来挑战