NC | E2-E3模块调控粮食作物的种子大小

学术   2024-08-01 17:18   浙江  
20235,中国农业科学院作物科学研究所刁现民团队于国际知名期刊Nature Communications发表了题为An E2-E3 pair contributes to seed size control in grain crops的研究论文。作者通过发掘谷子籽粒产量重要基因SGD1,确定了有助于提高粮食产量的SiUBC32-SGD1-BRI1遗传模块,而且为利用谷子模型系统探索控制禾本科作物重要性状的关键基因提供了策略。

研究背景

了解调节粮食产量的分子机制对于提高农业生产力非常重要,粮食产量是一个复杂的数量性状,由植物的各种基因调控和遗传途径决定。泛素化级联途径涉及泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。泛素化途径可通过调节目标蛋白在蛋白酶体的降解、调节蛋白稳定性和定位来控制谷物产量,一些参与谷物产量控制的泛素相关蛋白已被鉴定。

谷子(Setaria italica) (/小米)属于禾本科,是东亚重要的谷类作物,由于其形态和遗传特征,与其野生祖先狗尾草(Setaria viridis)可一起作为理想的研究模型。本研究使用谷子作为实验系统,鉴定了一种RINGE3连接酶SGD1及其E2伴侣SiUBC32SGD1泛素化油菜素甾醇受体BRI1,使其稳定并促进植物生长。

# 思维导图:

#根据原文整理,以原文为准,欢迎指正!

病症介绍

研究结果

1. 谷物籽粒产量相关突变基因的鉴定

由于植株每穗籽粒数和千粒重决定了谷子的籽粒产量,作者鉴定了谷子中与穗和种子发育相关的各种突变体,并在其中注意到了具小粒和矮化表型相关的两个突变等位基因(sgd1-1sgd1-2),其均表现出株高降低(1a-c)、圆锥花序和籽粒变小(1d-f)、籽粒数减少和千粒重降低(1g)。由于sgd1-1 × sgd1-2杂交产生的F1代与任一父母本突变体相比更像WT,因此表明其为等位基因突变导致的。此外,作者还发现种子尺寸减小是由于突变体中细胞扩张减少所致的(1i-k)

1. 谷子sgd1-1sgd1-2突变体的表型。(a–c)野生型Yugu1 (a)、突变体sgd1-1 (b)和突变体sgd1-2 (c)的生长状况。(d)圆锥花序表型。(ef)粒宽和粒长表型。(g)穗长、每穗粒数和千粒重统计。(h)粒长和粒宽统计。(i)树脂切片观察。(j)扫描电镜观察。(k)成熟种子中长轴和短轴的细胞长度、细胞宽度和细胞数量统计。


2. RINGE3泛素连接酶SGD1在调节谷子的籽粒产量中至关重要

作者首先通过遗传分析、图位克隆和MutMap分析,在SGD1 (Seita.9G123200)的基因编码区上鉴定到了有效的纯合突变(2a)。为确认其突变导致了表型的产生,作者构建了CRISPR-Cas9基因编辑系统载体并进行转基因。发现CRISPR-Cas9基因编辑株和突变体sgd1-1sgd1-2具相似表型(2b-d)。此外,在突变基础上转基因SGD1天然启动子驱动的SGD1-GFP可以挽救突变体表型(2b-f)SEM分析表明,转基因品系中籽粒大小的变化也与细胞大小的变化有关,而不是与细胞数量的变化有关(2e-f)。这一系列结果证实了Seita.9G123200即编码SGD1,其缺失导致突变表型的产生。

此外,亚细胞定位结果显示SGD1与内质网Marker共定位,表明SGD1除了之前报道的热传感功能外,还在内质网中具分子功能。SGD1在根、伸长的茎、叶和开花圆锥花序中检测到表达,在幼圆锥花序、种子和苗期根中表达相对较高(2k),同样支持SGD1在调节穗和种子发育中可能发挥作用。

2. SGD1的功能表征分析。(a) SGD1的基因结构及sgd1-1sgd1-2中的突变位点。(b)野生型、敲除株和表型挽救株的生长表型。(c)成熟种子表型。(d)圆锥花序表型。(e)扫描电镜分析。(f)千粒重、粒长宽、细胞长宽、细胞数统计。(g-j)亚细胞定位分析。(k) SGD1在不同生长阶段器官中的表达水平。


3. SGD1在禾本科主要作物中的功能保守

作者采取全基因组分析和生物信息学分析,发现SGD1基因编码RINGE3泛素连接酶,且在不同物种中保守,在水稻中使用CRISPR-Csa9系统敲除OsSGD1可致更短的圆锥花序、更小的籽粒、更少的籽粒每穗数量(3b-d)。为了进一步测试SGD1在调节谷物产量方面的作用是否在禾本科物种中保守,作者使用玉米中的两个SGD1同源物(Zm00001d013466Zm00001d033674)引入谷子sgd1突变体中,发现ZmSGD1也可挽救突变表型(2b-f)。此外,作者通过CRISPR-Csa9系统在六倍体小麦中创制的三重突变体也表现出了穗长、每穗粒数、籽粒大小和百粒重的显著减少(3f-h)。种种转基因实验结果表明SGD1在整个禾本科植物中具有保守的调节谷物产量的功能。

3. SGD1调节主要谷类作物的产量。(a)创制水稻OsSGD1-CRISPR编辑植株。(b-d)野生型和突变体水稻植株的圆锥花序,成熟籽粒和每穗粒数、百粒重、粒长和粒宽。(e)创制小麦TaSGD1-CRISPR编辑植株。(f)野生型和突变体小麦植株的圆锥花序,成熟籽粒和穗长、重量、每穗粒数、百粒重、粒长和粒宽。


4. SiUBC32直接与SGD1互作并调节谷物产量

为进一步研究SGD1的功能,作者分别使用亚细胞共定位、酵母双杂交筛选、体外GST Pull-down、荧光素酶互补实验、共免疫沉淀(Co-IP)实验鉴定得到SGD1SiUBC32在体内体外相互作用(4a-e)。作者通过泛素化活性检测发现SiUBC32-SGD1是功能性E2-E3泛素酶配对伴侣(4f),并使用CRISPR-Cas9系统创制了Siubc32Siubc32/sgd1突变体。Siubc32突变体相比WT,表现出矮化表型、较短的圆锥花序和较小的籽粒尺寸,同sgd1表型类似(4g-i)Siubc32/sgd1双突变体对植物生长发育表现出显著的抑制作用,与每个单突变体相比,双突变体在所有研究的性状中表现出更严重的减少(4g-k)。其中株高、叶长和圆锥花序长度的减少量远大于每个单突变体,表明这两个基因在调节这三个性状方面发挥加性作用。而对于与谷物产量相关的性状,包括千粒重、粒长和粒宽,在双突变体中的减少仅略大于每个单突变体中的减少,表明SGD1SiUBC32在调节粮食产量方面具有部分重叠的功能。因此作者认为SGD1至少部分地与SiUBC32通过共同的遗传途径来控制谷物产量相关性状。

4. SiUBC32直接与SGD1互作并调节谷物产量。(a) SGD1SiUBC32的亚细胞定位。(b) Y2H分析。(c) Pull-Down分析。(d)荧光素酶互补实验。(e) Co-IP分析。(f) SGD1E3连接酶活性测定。(g)野生型(WT)sgd1Siubc32sgd1/Siubc32的生长表型。(h-k)圆锥花序表型、籽粒表型、扫描电镜分析和穗长、千粒重、粒长、粒宽、细胞长宽表型统计。


5. SGD1参与BR信号传导

此前有研究报导狗尾草中具两种独特的BR相关生物活动,并引起刚毛发育和叶子下垂,而sgd1突变体表现出了类似的表型。作者使用eBL(一种活性BR)处理突变体,发现sgd1突变体对外源BL不太敏感(5c-g)。随后作者使用RNA-seqqPCR分析了BR相关基因的表达,发现野生型中经外源eBL处理后的DEGs中,只有很少一部分在sgd1突变体中有响应。综上,sgd1突变体对BR的敏感性降低,SGD1基因参与BR信号传导。

5. sgd1突变体对BR的敏感性降低。(a-b)野生型和sgd1的刚毛表型。(c-e) WTsgd1中叶对BR处理响应的表型。(f -g) WTsgd1的根生长表型。(h) WT-BL/WTdpy1/WTsgd1/WT植物中DEGBZR1靶标重叠的数量和靶基因表达模式的热图。(j-k) qRT-PCR分析。


6. SGD1BRI1互作并有助其稳定

作者在BR信号传导中发挥关键作用的候选蛋白中,先后使用荧光素酶互补、酵母双杂交、Pull-DownCo-IP实验筛选得到SGD1BRI1互作(6a-d)。由于E3泛素连接酶常与底物结合并靶向其进行泛素化,因此作者使用体外泛素化测定证实了SGD1可泛素化SiBRI1(6e-f),且对蛋白水平的检测以及后续对处理后突变体中蛋白水平的检验揭示了SGD1泛素化SiBRI1是为了稳定蛋白而非降解蛋白(6g-p)

为进一步确定SGD1SiBRI1之间的关系,作者在sgd1突变体背景中过表达SiBRI1,发现SiBRI1的过表达可以挽救部分突变体表型,转基因结果同样支持SGD1通过增强SiBRI1的稳定性促进BR信号传导

6. SGD1SiBRI1互作并增强SiBRI1蛋白稳定性。(a)荧光素酶互补实验。(b) Y2H(c) Pull-Down(d) Co-IP(e-j) SiBRI1泛素化水平检测。(k–p) SiBRI1蛋白丰度检测。(q-s) WTsgd1BRI1/sgd1的生长表型。


7.过表达SGD1的优产单倍型可提高谷子的产量

为了解SGD1在谷物驯化改良中的地位,作者利用高通量测序对1681份种质资源进行分析,发现SGD1在谷子育种改良中也经历了选择,且选择主要发生在启动子和内含子区域(7a-d)

在驯化过程中,H1H3H4单倍型频率增加。主要农艺性状的关联分析表明,SGD1H1单倍型与较高的穗重和粒重以及每穗的种子数较高相关,其对作物生产最有利,驯化过程中的频率增幅也最高(7e-f)。随后作者构建过表达H1株系,发现其具更大的籽粒、千粒重和穗长,导致单株的籽粒产量增加。

7. SGD1在驯化中的筛选改良与谷物产量的提高相关。(a-d)依据固定指数(Fst)进行全基因组选择性扫描分析。(e-f)单倍型分析统计。(g–k)野生型、sgd1OE-SGD1H1表型分析。

总结
在本研究中,作者利用谷子鉴定并鉴定了SiUBC32-SGD1-SiBRI1遗传模块。此外作者使用了完整的基因克隆、转基因、诱变等技术,进一步证实了谷子作为实验系统的可行性。受限于玉米、小麦等作物基因组复杂性的限制,谷子实验系统的完善,可能会加速未来在禾本科作物中优势基因的发掘。

期刊:Nature Communications

投稿日期:2022.10.13
接收日期:2023.5.15
发表日期:2023.5.29
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评述/编辑:朱晨昊
校对:高贺升

原文链接(点击“阅读原文”)


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