2024年4月，中国科学院植物研究所植物分子生理研究团队在著名期刊The Plant Cell上发表了一篇题为The heat shock factor 20-HSF4-cellulose synthase A2 module regulates heat stress tolerance in maize的文章。作者对玉米基因敲除株系Zmhsf20进行表型分析，利用RNA-Seq、qPCR、H2O2测定等实验，确定玉米中转录因子ZmHSF20响应热胁迫的生理功能。通过DAP-seq、CUT&Tag-qPCR、EMSA等实验技术，进一步阐述ZmHSF20与ZmHsf4、ZmCesA2的作用关系，完善了玉米的热胁迫响应机制。![]()
=== 研究背景 ===
植物热胁迫反应(HS)的调控机制对于玉米在内的气候适应型作物非常重要。热激转录因子(HSFs)是植物热激反应的关键调控因子，根据结构特性可分为A、B和C三个家族。当植物经历高温胁迫时，HSFs可以与下游基因启动子中存在的顺式调控元件热激响应元件(HSE)结合，调节热激蛋白基因(HSP)的转录，对植物生长发育和逆境响应具有重要作用。已有研究表明植物受到HS可降低体内蛋白质稳定性，导致内质网错误折叠蛋白和活性氧的积累。然而，玉米对HS反应的调控机制还有待进一步研究。# 思维导图： ![]()
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=== 研究结果 ===
1、鉴定与HS反应相关的关键转录因子
作者在45℃条件下对玉米幼苗进行热胁迫处理，并采集转录组测序数据，通过DGEs、WGCNA和基因GO富集分析，发现ZmHsf20在共表达调控网络中是连接数量最多的前3个HSF之一，且ZmHsf20在HS下被强烈诱导表达，确定了玉米在HS响应中可能起作用的转录因子ZmHsf20。![]()
图1.玉米HS响应下的基因调控和共表达网络分析。(A)不同时间热响应下基因表达热图。(B)基因富集(GO)分析。(C) 响应HS的基因数量。(D)共表达网络分析。
2、ZmHSF20负调控玉米耐热性
为了探索ZmHSF20在HS中的功能，作者通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术获得了两个玉米敲除系Zmhsf20-1、 Zmhsf20-2；通过从玉米泛素(Ubi)启动子中驱动ZmHsf20编码序列建立两个过表达株系ZmHsf20-OE#1、ZmHsf20-OE#2。通过45℃热胁迫处理，测定植株存活率、离子渗透率、H2O2水平，结果表明Zmhsf20相比野生型和过表达株系表现出更强的耐热性。![]()
图2. ZmHsf20调节玉米耐热性。(A)构建Zmhsf20敲除株系。(B)构建ZmHsf20过表达株系。(C) WT、Zmhsf20-1和Zmhsf20-2玉米幼苗在45℃热胁迫处理3 d后再恢复3 d的表型。(D) WT、ZmHsf20-OE#1和ZmHsf20-OE#2玉米幼苗在45℃热胁迫处理2 d后再恢复3 d的表型。(E, F) C、D中株系在28℃/22℃下恢复3 d后的幼苗成活率。(G, H) 不同株系在45℃下处理1 d的离子渗透率。(I, J) 不同株系在45℃下处理1 d的叶片DAB染色。
3、ZmHSF20与ZmCesA和ZmHsfA相互作用
为了确定ZmHSF20的作用靶点，作者对Zmhsf20-1和WT进行了转录组测序，通过DEGs和GO富集分析，得到结果上调的基因主要富集在“去磷酸化”、“植物型次生壁”、“纤维素合成酶活性”中。通过DNA亲和纯化测序(DAP-seq)，发现启动子区域含有ZmHSF20结合峰的基因也主要富集在“蛋白质折叠”、“热响应”和“纤维素合成酶”中。此前研究表明，玉米ZmCesA2过表达系表现出更高的耐寒性。作者通过RT-qPCR分析，发现与WT相比，Zmhsf20中ZmCesA基因的转录水平显著上调。通过YIH实验，作者确定了ZmHSF20与ZmHsf4的启动子结合。通过CUT&Tag-qPCR和EMSAs进行靶点切割和标记，确定ZmHSF20与ZmCesA2和ZmHsf4启动子结合。通过LUC实验，作者证明了ZmHSF20直接抑制ZmCesA2和ZmHsf4转录。![]()
图3. ZmHSF20结合ZmCesA2启动子并抑制其转录。(A) Zmhsf20-1和WT株系热胁迫处理后GO富集分析。(B) DAP-seq鉴定ZmHsf20结合基因GO富集分析。(C) CUT&Tag实验显示ZmHSF20在体内与ZmCesA2的启动子结合。(D) EMSA验证ZmHSF20在体外与ZmCesA2的启动子结合。(E) 烟草瞬时表达ProZmCesA2:LUC报告基因。(F) ProZmCesA2:LUC活性的定量分析。
4、ZmHSF4正调控耐热性，并在ZmHSF20下游发挥作用
为了探索ZmHsf4的作用，作者创制了两个基因敲除株系 (Zmhsf4-1和Zmhsf4-2)。通过45℃热胁迫处理，测定植株存活率、离子渗透率、H2O2水平，结果表明Zmhsf4相比野生型和过表达株系表现出更低的耐热性。HS处理后，通过qPCR验证ZmHSP70在Zmhsf4突变株中的表达水平明显低于WT，而在ZmHsf4-OE系中的表达水平则高于WT。上述结果表明，ZmHSF4正调控玉米HS反应。为了研究ZmHsf20与ZmHsf4的调控关系，作者创制Zmhsf20-1 Zmhsf4-1双敲株系，经过热处理，双敲株系相比WT表现更低的耐热性。Zmhsf20功能的丧失并没有抑制Zmhsf4-1的热敏表型。这些结果表明，ZmHSF4在HS应答中作用于ZmHSF20的下游。![]()
图4. ZmHSF20下游靶基因ZmHsf4调控玉米耐热性。(A) CUT&Tag实验显示ZmHSF20在体内与ZmHsf4的启动子结合。(B) EMSA验证ZmHSF20在体外与ZmHsf4的启动子结合。(C) 烟草瞬时表达ProZmHsf4:LUC报告基因。(D) ProZmHsf4:LUC活性的定量分析。(E) WT、Zmhsf4-1和Zmhsf4-2玉米幼苗在45℃热胁迫处理2 d后再恢复3 d的表型。 (F) WT、ZmHsf4-OE#1和ZmHsf4-OE#2玉米幼苗在45℃热胁迫处理3 d后再恢复3 d的表型。(G、H) C、D中株系在28℃/22℃下恢复3 d后的幼苗成活率。(I、J) 不同株系在45℃下处理1 d的离子渗透率。
5、ZmHSF4激活ZmCesA2的表达
通过上述的实验，证明ZmHsf20调控ZmCesA的表达。因此作者推测ZmHsf4也可能影响HS下ZmCesA的表达。通过qPCR，作者发现Zmhsf4中ZmCesA2表达显著下调；通过CUT&Tag-qPCR，发现ZmHSF4与ZmCesA2的启动子结合；通过LUC实验，证明了ZmHsf4激活了ZmCesA2转录。为了研究ZmCesA2在玉米的生物功能，作者利用ZmCesA2-OE株系证明ZmCesA2提高玉米的耐热性，增加了玉米植株的纤维素含量，同时qPCR实验表明ZmCesA2 -OE对细胞壁中果胶、木质素合成相关基因的表达升高。通过透射电镜(TEM)分析，在HS条件下，WT细胞壁结构出现坍塌，而Zmhsf20和ZmHsf4-OE细胞壁结构相对完整，意味着Zmhsf20和ZmHsf4-OE可能直接或间接介导高温胁迫下的细胞壁发育，从而提高玉米的耐热性。![]()
图5. ZmHSF4结合ZmCesA2启动子并激活其转录。(A) CUT&Tag实验显示ZmHSF4在体内与ZmCesA2的启动子结合。(B) EMSA验证ZmHSF4在体外与ZmCesA2的启动子结合。(C) 烟草瞬时表达ProZmCesA2:LUC报告基因。(D) ProZmCesA2:LUC活性的定量分析。(E) WT、ZmCesA2-OE#3和ZmCesA2-OE#6玉米幼苗在45℃热胁迫处理4 d后再恢复3 d的表型。(F) WT、Zmhsf20-1、Zmhsf4-1、Zmhsf20-1 Zmhsf4-1玉米幼苗在45℃热胁迫处理2 d后再恢复3 d的表型。(G)F中各株系在28℃/22℃下恢复3 d后的幼苗成活率。
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附图1. ZmHsf基因在45°C处理下表达上调。
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附图8.Y1H证明HSF20与ZmHsf4的启动子结合。
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附图16.HS处理下纤维素含量测定。
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附图17. ZmHsf20、ZmHsf4和ZmCesA2对细胞壁调控基因表达的影响。
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附图18. 在正常和HS条件下 WT、Zmhsf20和ZmHsf4-OE细胞壁结构。
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附图21. 不同基因型玉米照片。
=== 总结 ===
综上所述，该研究发现玉米中ZmHsf20、ZmHsf4、ZmCesA2相应地调节玉米耐热性，同时，ZmHsf4、ZmCesA2受到ZmHsf20的转录调控，ZmCesA2也受到ZmHsf4的转录调控，ZmHsf20-ZmHsf4-ZmCesA2组成的模块还影响着玉米纤维素含量和细胞壁合成相关基因的表达，可能影响其对非生物胁迫的耐受性。![]()
玉米ZmHSF20在HS中的作用模式图
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
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