2024年2月中国林科院李全梓研究员团队在The Plant Cell发表了题为Transcription factor PagMYB31 positively regulates cambium activity
and negatively regulates xylem development in poplar的研究论文，文章揭示转录因子PagMYB31在协同调控杨树木材发育过程不同阶段中发挥的重要作用，并构建其介导的转录调控网络。
木材的形成包括维管形成层的细胞分裂、木质部细胞的扩张、次生细胞壁（SCW）的沉积和程序性细胞死亡。在本研究中，作者在杨树 (Populus alba × Populus glandulosa) 中鉴定出PagMYB31作为调控这些过程的关键调控因子，并构建了PagMYB31介导的转录调控网络。PagMYB31突变导致形成层细胞层数变少，纺锤形起始细胞、射线起始细胞、导管、纤维和射线细胞变大，木质部细胞SCW增厚增强，表明PagMYB31正调控形成层细胞增殖，负调控木质部细胞扩展和SCW生物合成。PagMYB31分别通过直接抑制细胞壁修饰酶基因和激活整个SCW生物合成程序的转录因子基因来抑制木质部细胞扩张和SCW加厚。PagMYB31可能是操纵木材形成不同发育阶段的潜在靶点。# 思维导图：
#根据原文整理，以原文为准，欢迎指正！
|
=== 研究结果 ===
1. PagMYB31在P. alba × P. glandulosa茎的不同类型细胞中表达
根据RNA-seq数据，作者推测AtMYB69 (AT4G33450) 的同源基因PagMYB31在分化的木质部中大量表达。RT-qPCR分析证实，PagMYB31在木质部和幼根分化过程中的转录丰度较高，而在叶片和韧皮部-形成层中的转录丰度较低。为了进一步研究PagMYB31的详细表达模式，在P. alba × P. glandulosa中，作者构建了PagMYB31的GUS载体。对其转基因植株进行GUS染色后发现在初生生长的茎中，维管束中明显可见GUS信号，并且在木质部和韧皮部细胞中均有信号。在次生生长的茎中，分化木质部的纤维细胞、维管和射线细胞以及形成层和韧皮部中均可以观察到GUS信号。图1. PagMYB31在P. alba × P. glandulosa中的表达模式。(A) RT-qPCR分析PagMYB31在不同组织的表达。(B-F)MYB31p-GUS转基因杨树的GUS染色观察2. CRISPR介导的PagMYB31敲除影响形成层活性、木质部细胞扩增和SCW的生物合成
为了研究PagMYB31在木材形成过程中的功能，作者利用CRISPR/cas9介导的基因编辑技术生成PagMYB31功能缺失突变体并对其进行鉴定。表型分析发现2月龄myb31-7与野生型植株具相同的生长速率，而3月龄突变体植株开始呈现较慢的生长速度。对第5、10、15节间茎横截面的细胞学观察显示，突变体与WT的解剖结构存在差异。在第5节间的茎横截面上，myb31-7突变体的韧皮部帽结构更明显，韧皮部纤维细胞壁增厚增强，myb31-7突变体在第15节间的次生木质部的细胞层较少，其细胞层数量约为WT的一半。扫描电镜下观察发现了myb31-7突变体的维管和纤维细胞均较大，而通过测量分离的木质部细胞发现，myb31-7突变体的维管和纤维细胞的长度均短于WT，表明PagMYB31在纵向正向调控木质部细胞的扩张，而在径向负调控木质部细胞的扩张。与WT相比，myb31-7突变体的木质部纤维细胞壁更厚、维管壁和射线细胞壁也更厚、纤维素和木聚糖含量更高、木质素含量没有显著差异。获得的另一个突变体myb31-11表现出与myb31-7相同的表型。这些细胞学观察结果表明，PagMYB31突变导致形成层活性降低，但促进了木质部细胞的扩张和SCW的形成。图2. PagMYB31突变降低形成层活性，促进细胞扩张和SCW生物合成。(A) myb31突变体和野生型植株。(B) myb31-7的编辑类型。(C) Western blotting未检测到myb31-7突变体分化木质部中的PagMYB31蛋白。(D) PagMYB31蛋白在myb31-7和WT植物茎横切面的细胞免疫定位。(E) 5月龄植株的高度。(F) 7月龄植株的茎直径。(G) 第5和第10节间茎横切面的细胞学观察显示木质部发育增强。(H) 第12节间茎横截面扫描电镜观察。(I) 第10节间形成层区域的放大图像。(J) 形成层切向切片的细胞学观察。(K) 形成层切向断面的扫描电镜观察。(L) 第10节间形成层细胞层数。myb31-7突变体形成层细胞较少。(M) 纤维细胞和管腔面积。(N) 维管、纤维细胞和射线细胞的壁厚。(O) 纳米压痕分析。3. PagMYB31-OE或PagMYB31:SRDX与myb31突变体相比对杨树作用效果相反
作者接着构建了PagMYB31-OE并获得转基因植株。与野生型相比，转基因植株的生长速度有所下降，对第10节间茎横截面的细胞学观察显示，OE转基因植株的木质部均较WT较窄。在扫描电镜下测量了茎横截面上的木质部细胞壁厚度发现OE-17和OE-5的纤维细胞和维管的壁厚均显著下降。通过细胞腔面积测量，作者观察到OE-17的维管比WT组更小。作者还统计了形成层区域的细胞层数，并观察到OE-17和OE -5的细胞层数显著增加。木材的成分分析表明，OE-17和SRDX-19中的纤维素和木聚糖含量均降低，这与myb31-7突变体的变化相反。图3.在P. alba × P . glandulosa中过表达FLAG：PagMYB31抑制木质部发育和SCW增厚。(A) WT植株和PagMYB31-OE转基因株系5和17(OE-5和-17)。(B) Western
blotting检测OE-17、OE-5和WT分化木质部中PagMYB31蛋白，(C) RT-qPCR分析PagMYB31在WT、OE-5和OE-17分化木质部中的表达。(D) 1月龄植株的高度。(E、 G) WT、OE-5和OE-17第10节间和第12节间茎横截面的光学显微镜和扫描电镜细胞学观察。(F-I)第10节间茎横切面木质部宽度(F),第12节间导管和纤维细胞壁厚(H),导管和纤维细胞腔面积(I)的测定。(J) WT、OE-5和OE-17形成层区域的放大图像。(K)形成层细胞层数。4. 转录组分析显示PagMYB31是SCW形成的负调控因子
作者对2月龄植株茎第7节下方的木质部侧刮取材料，对木质部进行了高通量转录组分析。依据KEGG和GO分析结果，作者检查了在SCW形成过程中，编码木质素、纤维素和半纤维素生物合成的必需酶的基因的表达，多数在突变体分化木质部中上调表达，在OE转基因植株分化木质部中下调表达。作者还观察了myb31-7突变体和OE转基因植物分化后木质部中参与木材形成的基因的表达。在SCW生物合成TRN顶层的NAC基因中，PagVND6-A2、B1和C1在myb31-7突变体中显著上调。作者进一步进行了snRNA-seq，大多数TF和细胞壁代谢物基因表现出与RNA-seq相同的表达变化。图4.myb31-7突变体、FLAG：MYB31和MYB31：SRDX转基因植株分化木质部的转录组分析。(A-D)相关基因的表达热图。(E) 通过snRNA-seq对与形成层和木质部相关的簇的UMAP表示。(F) 形成层向木质部分化的假时间轨迹。(G) 小提琴图可视化，以比较WT和myb31-7在木质部簇1和20中的表达水平。(H) UMAP可视化显示了在空间转录组学中识别的细胞簇，每种颜色表示一个独特的细胞簇。(I)第9节间的伊红染色切片的图像上的簇。5. PagMYB31通过直接抑制调控SCW生物合成的关键TF基因来调控SCW的形成
为了研究PagMYB31的变化如何影响SCW的生物合成，作者通过ChIP-seq和RNA-seq的组合进行了鉴定，确定了PagMYB31的直接靶点。通过整合数据，共鉴定出252个PagMYB31直接靶点，这些靶点在myb31-7突变体的分化木质部中上调，而在OE转基因植株中下调。为了验证ChIP结果，选取了11个基因进行了 Y1H 和报告检测，结果均支持ChIP结果和PagMYB31的抑制因子活性。ChIP-seq/qPCR共鉴定出8个编码PagMYB31的候选直接靶点，此外Y1H还检测到了PagMYB31与8个基因中7个启动子的相互作用。作者选择了PagSND1-A2、MYB3/20和21进行双荧光素酶报告分析，结果显示PagMYB31可以显著抑制其启动子活性。综上，PagMYB31直接负调控PagSND1-A2、MYB3/20、74、VND6-A2、B1和C1，myb31-7突变体中SCW生物合成的增强可能是由这7个TF基因的上调引起的。图5.PagMYB31通过直接抑制调控SCW形成的TF基因来调控SCW的生物合成。(A) ChIP-qPCR检测PagMYB31与SCW生物合成的8个TF基因启动子之间的相互作用。(B) PagMYB31的Y1H测定及其靶标。(C) 基于效应子-报告子的激活/抑制测定显示，PagMYB31抑制PagSND1-A2、MYB21和20/3的启动子活性。6. PagMYB31正调控形成层活性
先前通过对基因编辑和转基因植株茎的解剖结构观察发现PagMYB31正向调控形成层活性。为了检测形成层细胞中的基因表达，作者从RNA测序的结果中研究了已知在杨树形成层中起作用的蛋白质编码基因，发现在myb31-7突变体中，PagWOX4a/b的转录本丰度显著低于WT，其中PagWOX4b的转录本丰度特别低。在snRNA-seq分析中，cluster7和13被描述为形成层细胞。作者观察到myb31-7突变体的cluster13中PagWOX4b和CLE47下调，myb31-7突变体的cluster7中PagWOX4b和VCM2下调，这与RNA-seq结果一致。在空间转录组分析中也检测到形成层区PagWOX4的下调。结果显示，PagMYB31突变影响了形成层增殖相关基因的表达。ChIP-seq和RNA-seq在韧皮部-形成层中的整合确定了PagMYB31的一些直接靶点。Y1H检测也支持PagMYB31结合了这5个基因的启动子。进一步的双荧光素酶报告分析显示，PagMYB31可以激活PagWOX4b、CLE47和VCM2的启动子活性，表明PagMYB31直接且正向调控这3个基因。在95个维管形成层特异性TF基因中，PagMYB72(VCS60)和PagMYB196(VCS74)是唯一的2个基因上调的MYB。形成层RNA-seq分析和空间转录组分析也显示PagMYB72的myb31-7突变体。作者还进行了效应-报告基因分析，观察到PagMYB72显著抑制了PagWOX4b、VCM2和MYB199的启动子活性，推测PagMYB31可能通过PagMYB72调控PagWOX4、VCM2和MYB199的表达。图6. PagMYB31直接调控形成层增殖相关基因的表达。(A) 热图显示了WT、myb31-7突变体、PagMYB31-OE和PagMYB31:SRDX-OE(SRDX)转基因植物韧皮部-形成层中参与形成层细胞增殖的基因的表达水平变化。(B) RT-qPCR证实了在myb31-7突变体的韧皮部-形成层中PagWOX4、VMC2、MYB199和PIN5的下调以及PagMYB72和196的上调。(C) 代表形成层细胞的簇7和13的UMAP可视化(左)，以及通过snRNA-seq在myb31-7突变体的形成层簇中下调PagWOX4、CLE47和VCM2的可视化(右)。(D) ChIP-qPCR显示PagMYB31与PagWOX4、CLE47、MYB199、VCM2和MYB72的启动子结合。(E) PagMYB31和PagWOX4、CLE47、MYB199、VCM2和MYB72启动子的Y1H测定。(F) 效应子-报告子分析显示，PagMYB31激活PagWOX4、VCM2和CLE47的启动子活性，但抑制PagMYB72的启动子活动。(G) 效应子-报告子反式激活/抑制测定显示，PagMYB72抑制PagWOX4b、VCM2和PIN5的启动子活性。7. PagMYB31调控细胞的扩张和生长
细胞学观察显示，与WT相比，myb31突变体分化木质部的纤维细胞和维管更大、形成层中纤维起始细胞和射线起始细胞也明显较大。作者研究了编码与壁扩张相关的壁修饰酶的表达。RNA-seq分析显示，突变体中有大量的壁修饰酶基因差异表达，其中10个在韧皮部形成层，29个在分化木质部。ChIP-seq鉴定关于PagMYB31的直接靶点中，通过RNA-seq分析，共有12个壁修饰酶编码基因在该31-7突变体中差异表达。作者选择了5个基因进行ChIP-qPCR实验，并确认了其启动子中通过抗PagMYB31抗体免疫沉淀的富集DNA片段。对2个选定基因PagEXPB3和PagXTH10的Y1H检测支持ChIP结果。PagEXPB3和PL3可能参与了形成层区细胞的扩张和木质部的分化。图7.PagMYB31调节形成层和木质部细胞的扩张。(A) 热图显示了壁修饰酶基因的表达，包括膨胀素(EXPA)基因、XTH基因和PL基因在韧皮部-形成层A)和分化木质部B)中的表达。(C) 小提琴图可视化，通过snRNA-Seq比较WT和myb31-7植物形成层和木质部簇中壁修饰酶基因的表达水平。(D) ChIP-qPCR检测PagMYB31与5个壁修饰酶基因启动子的结合。(E) 用PagEXPB3和PagXTH10的启动子对PagMYB31进行Y1H测定。8. PagMYB31介导的TRN
为了构建PagMYB31介导的TRN，作者选择了6个被鉴定为PagMYB31靶点的TF基因，并进行了ChIP-seq检测。将这6个TF基因与3×FLAG标签融合，通过根癌农杆菌瞬时转化杨树植株。ChIP-seq分析显示，这6个转录因子可以与19个细胞壁代谢物基因中至少1个的启动子结合，符合ChIP-qPCR的结果。结合RNA-seq、ChIP-seq、Y1H和双荧光素酶报告实验，作者构建了一个PagMYB31介导的TRN，该基因包含58个TF-DNA相互作用。TRN分析表明，PagMYB31直接调控细胞膨大、PCD和SCW的生物合成，而在形成层中，PagMYB31直接和间接调控PagWOX4。图8. MYB31介导的TRN调控木材形成的不同发育步骤，包括形成层细胞增殖、木质部细胞扩张和SCW生物合成
作者发现，PagMYB31是在木材形成过程中调节形成层增殖、木质部细胞扩张、SCW增厚和PCD的协调者。它在木材形成过程中具有双重作用，正向调控形成层增殖，负向调控木质部细胞发育(细胞扩张和SCW增厚)。作者的研究结果表明，PagMYB31分别通过直接抑制壁修饰酶基因和木材形成调控基因来负调控细胞的扩张和SCW的增厚，而通过多种途径调控PagWOX4的表达来调控形成层的活性。它的活动是需要在协调连续的发育步骤的木材形成。
期刊：PLANT
CELL
------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
～ The End! ～
![]()
