2024年7月，中国科学院分子植物科学卓越创新中心李来庚研究员团队在Plant, Cell & Environment上在线发表了一篇题为 “A molecular module connects abscisic acid with auxin signals to facilitate seasonal wood formation in Populus”的研究论文，该研究揭示了AREB4/AREB13-VCM1/VCM2-PIN5b作为连接ABA和生长素信号的分子模块，控制季节性木材形成中的维管形成层活动，为理解季节性木材形成提供了新的见解。
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多年生树木每年都会有一个周期性的木材形成周期，以应其对环境的波动。然而，调节木材季节性形成的分子机制仍然知之甚少。VCM1和VCM2(VCMs)这两种典型的MADS-box转录因子对杨属中的维管形成层活性负向调节。VCMs正向调节PIN-FORMED5b（PIN5bs）的表达，从而影响形成层细胞中生长素的浓度，进而影响杨树的径向生长。然而激素调节网络之间的相互联系仍不清楚。
1.杨树季节性生长过程中VCM1和VCM2的表达表现出与光周期相关的季节变化
在作者前期的研究中，发现VCM1和VCM2对杨树维管形成层活性具有负调节作用，于是作者分析了生长季节期间杨树的发育木质部中VCM1和VCM2的表达情况。结果表明，VCM1和VCM2的表达在3月份恢复生长之前较高，并随着树木生长激活而逐渐下降；在秋季随着树木进入休眠期，VCM1和VCM2的表达显著增加（图1a）。接着作者研究了光周期变化对VCM1和VCM2表达的影响，将杨树在长日照（LD：16小时光照和8小时黑暗）和SD（8小时光照和16小时黑暗）条件下培养30天后，与LD处理相比，SD处理导致VCM1、VCM2和PIN5b的表达增加，但这种增加在前5天并不明显。作者还研究了生物钟是否影响VCM1和VCM2的表达，在24小时昼夜节律周期中没有观察到表达的显著变化（图1b）。这表明SD时间的积累会影响VCM1和VCM2的转录，而昼夜节律在短期内影响不大。作者还研究了温度如何影响VCM1和VCM2的表达，将植物在4°C的生长条件下生长18天后发现VCM1和VCM2表达没有显著的变化（图2b）。以上结果表明尽管VCM1和VCM2表现出相似的表达模式，但两者在表达水平以及对光周期和温度变化的响应方面似乎存在一些差异，在生长和季节波动过程中，光周期是影响杨树VCM1和VCM2表达的主要因素。![]()
图1.杨树中VCM1和VCM2表达的季节变化。(a)通过qRT-PCR分析当年3月至11月VCM1和VCM2的表达情况。(b)在LD和SD下生长的杨树的木质部组织发育中VCM1、VCM2和PIN5b的表达情况。
2.光周期变化介导VCM1和VCM2表达调节杨树茎生长
为了探究光周期的变化对杨树中VCM1和VCM2的表达影响，作者研究了在LD和SD条件下，VCM1和VCM2表达对生长1个月的WT（野生型）和VCM-DR（VCM1和VCM2下调）转基因植株的影响。WT（野生型）和VCM-DR植物在LD条件下表现出正常生长，但在SD条件下，WT表现出顶端生长停止并发育出紫色芽鳞，表明诱导了芽集，而VCM-DR转基因在SD条件下表现出正常的顶端生长（图2a），表明VCM-DR转基因对SD处理不敏感，并且需要VCM来调节生长变化。接下来，作者研究了LD和SD条件下的茎二次生长。在LD条件下，WT和VCM-DR植物都有活跃的维管形成层增殖，形成层区有大约五层细胞（图2b，c）。当WT植物处于SD条件下时，维管形成层增殖受到抑制，导致形成层区域的细胞层数减少。但VCM-DR植物中的维管形成层活性几乎没有改变，且维管形成层细胞层与LD条件下的类似（图2b，c）。这表明VCM1和VCM2对于响应SD条件和调节维管形成层活动至关重要。![]()
图2.光周期影响VCM1和VCM2转录以调节形成层活动。 (a) SD诱导WT植物中休眠顶芽的形成，但不诱导VCM-DR 植物中休眠顶芽的形成。(b)在LD和SD条件下观察WT和 VCM-DR植株第13节间的横切面的形成层活性。(c)形成层区的细胞层进行测量。
3.光周期变化影响木质部发育过程中ABA和生长素信号传导
为了探索杨树转录水平的变化，作者对LD和SD条件下杨树茎的RNA 测序。RNA-Seq结果显示，与LD相比，SD中的DEG包含1906个上调基因和2813个下调基因（图3a、b）。富集分析表明主要与细胞壁形成、转运蛋白活性、休眠、分生组织活性、木质部发育和激素信号传导有关，特别是与生长素和ABA途径有关的DEG（图3c）。在DEG中，VCM1和VCM2以及靶基因PIN5b的表达在SD下显著增加（图3d）。在SD条件下，用于ABA生物合成的基因NCED3和用于ABA输入的基因ABCG40上调，参与ABA分解代谢的基因，如CYP707A1下调（图3d，e），表明SD刺激了ABA相关基因的表达积累。此外，生长素响应基因（例如GH3、SAUR和ARF家族中的基因）的表达在SD条件下活性要低得多（图3d）。作者还发现当VCM-DR转基因植物在LD和SD条件下生长时，SD对ABA和生长素相关基因的表达影响不太显著（图3a）。转录活性分析表明，光周期的变化导致茎维管组织中响应生长素和ABA的转录变化，并且这种变化是VCM依赖性的。![]()
图3. LD和SD条件下杨树茎的RNA 测序。 (a)火山图描绘了LD和SD 条件下的差异表达基因(DEG)。(b) SD和LD条件之间的DEG数量。(c)基因本体（GO）富集分析证明了各种过程中涉及的DEG的富集。(d)热图显示LD和SD条件下的转录本。(e)通过qRT-PCR在LD和SD下生长的WT茎中验证ABA相关基因的转录。
4.SD导致杨树茎中ABA积累，诱导VCM1和VCM2表达
为了探究SD和ABA与VCM1和VCM2的关系，作者克隆了VCM启动子并生成了PVCM1-GUS转基因植物。当PVCM1-GUS转基因植物的茎横截面用ABA处理时，ABA强烈诱导VCM1启动子活性（图4b）。作者用ABA处理WT和VCM-DR植物，随着ABA的施用，WT停止生长并逐渐形成休眠芽，而VCM-DR植物仍保持活跃生长而没有形成休眠芽（图4c）。茎横截面显示，在没有外源ABA处理的情况下，WT和VCM-DR植株均表现出正常的形成层活性，但VCM-DR植株形成层很宽，由形成层区的几层细胞组成（图4d-f）。施用外源ABA后，WT植物中维管形成层的增殖受到抑制，形成层细胞层数减少和形成层区域变窄。然而经过外源ABA处理的VCM-DR植物的形成层增殖没有表现出显著的变化，并且形成层细胞层数仍然与没有外源ABA的VCM-DR植物相似（图4d-f）。作者还测量了ABA处理后VCM1和VCM2的表达，结果表明，ABA处理抑制WT植物茎组织中维管形成层活性并上调VCM1和VCM2基因的表达，但它对VCM-DR植物的维管形成层活性影响不大。以上结果表明SD导致ABA在茎中积累，从而诱导VCM1和VCM2的表达，进而调节杨的维管形成层活性。
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图4. ABA积累刺激VCM1和VCM2表达，同时抑制维管形成层活性。(a)在LD和SD条件下通过HPLC定量干维管组织中的ABA含量。(b) ABA增强VCM1启动子的活性。(c) ABA诱导休眠顶芽的形成情况。(d) ABA对维管形成层活性的影响。(e) ABA对形成层宽度的影响。(f) ABA对形成层区细胞层数的影响。
5.SD和ABA诱导AREB4和AREB13的表达
为了探究SD和ABA与AREB4和AREB13的关系，作者在LD和SD条件下通过qRT-PCR分析对AREB1、AREB4、AREB5、AREB8、AREB9和AREB13的表达进行定量分析。结果进一步表明，在SD条件下，AREB4和AREB13在干组织中被显著诱导，表达最丰富（图5a）。相反，将ABA应用于杨树导致茎组织中AREB4和AREB13的表达显著增加（图5b）。这些发现表明AREB4和AREB13可能是杨树干中在SD条件下对ABA做出反应的主要AREB转录因子。![]()
图5. VCM1和VCM2启动子的转录活性。(a)在LD和SD条件下通过qRT-PCR分析对AREB1、AREB4、AREB5、AREB8、AREB9和AREB13的表达进行定量分析。(b)在ABA处理下通过 qRT-PCR分析对AREB4和AREB9的表达进行定量分析。(c)双荧光素酶报告分析。
6.AREB4和AREB13结合VCM1和VCM2启动子
为了进一步了解ABA信号如何控制VCM1和VCM2的表达，作者采用双荧光素酶报告系统来检测AREB4和AREB13是否具有激活VCM1和VCM2转录的能力，结果表明，AREB4和AREB13都能够激活由VCM1和VCM2启动子控制的荧光素酶报告基因（图5c，d）。作者还进行了EMSA实验验证AREB4和AREB13与VCM1和VCM2启动子结合。EMSA结果表明，AREB4和AREB13与VCM1启动子的P2片段（图6a）和VCM2启动子的P3片段（图6b）结合，但不与任何其他片段结合。这表明AREB4和AREB13与VCM1有直接相互作用。![]()
图6. EMSA实验表明AREB4和AREB13结合VCM1和VCM2启动子。(a) AREB4和 AREB13结合VCM1-P2启动子片段。(b) AREB4和AREB13结合VCM2-P3启动子片段。
综上所述，VCM1和VCM2作为连接光周期、ABA和生长素的纽带，控制着多年生树木次生生长的季节变化。这为深入解控制树木季节性生长的分子调控网络和理解树木生长和发育以及树木改良至关重要。![]()
图7.杨木形成过程中脱落酸和生长素信号响应季节性光周期变化的分子机制。
期刊：Plant, Cell & Environment
投稿日期：2024.04.05
接收日期：2024.06.25
发表日期：2024.07.04
评述/编辑：吴凤霞
校对：项珩喆
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