2023年3月，四川农业大学张帆教授在知名期刊International Journal of Biological Macromolecules上发表了题为Integrating physiological and transcriptome analyses clarified the molecular regulation mechanism of PyWRKY48 in poplar under cadmium stress的论文。本研究获得了PyWRKY48过表达的杨树，并对其在镉污染的土壤中对其进行了功能验证，以分析该基因对杨树生长、镉耐受性和镉积累的影响。RNA seq数据显示该基因与镉胁迫有关。这可能为提高镉污染土壤的植物修复效率提供强有力的分子基础和新思路。重要的是，转基因杨树比野生型杨树生长得更好，并且积累了更多的镉。因此，PyWRKY48过表达的杨树可用于减轻环境污染。这为研究杨树耐受重金属胁迫的分子机制提供了参考。![]()
=== 研究背景 ===
镉是对人类危害最严重的重金属之一，在生物体中具有很高的迁移性；极低浓度的镉对人体健康有害。虽然植物可以吸收镉并将其运输到芽中，但这对于它们的生长和代谢并不是必需的。当植物受到镉毒害时，其生长、光合作用和新陈代谢都会受到抑制。许多研究已经证实了WRKY转录因子（TFs）在环境胁迫下植物中的调节作用。同时WRKY TF在镉耐受性中的作用已有报道，但其在镉胁迫下的机制仍不清楚。
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=== 研究结果 ===
1. PyWRKY48的序列和表达分析
为了研究PyWRKY48基因在杨树响应镉胁迫中的功能，从云南杨中克隆了PyWRKY48。核苷酸序列的多重比对表明，毛果杨、白杨、胡杨、茶树、芝麻、可可和黑海藻具有与PyWRKY48同源的基因（图1A）。系统进化树显示PyWRKY48与毛果杨基因密切相关（图1A）。PyWRKY48的氨基酸序列包含WRKY结构域和C2-H2锌指（图1B）。作者使用了GUS染色、PCR和RT-qPCR用于检测PyWRKY48过表达株系，筛选出2个高表达株系（OE-32、OE-67）（图1C、D）。为了分析PyWRKY48在云南杨中的表达模式，采用RT-qPCR检测PyWRKY48在根、茎和叶中的相对表达水平，并以WT（84K杨树）组织中PyWRKY48的表达水平作为对照。表达模式显示，PyWRKY48的表达量根>叶>茎（图1E）。此外，图1F显示了镉胁迫（镉处理为200 mg/kg Cd2+）48 h时杨树中PyWRKY48的动态表达模式，以各组织0 h时的表达水平作为对照。PyWRKY48在叶和根中的相对表达量首先增加，并在12 h时达到峰值。亚细胞定位表明PyWRKY48定位于细胞核内（图1G）。因此，可以推断杨树收到镉胁迫会诱导PyWRKY48的表达。![]()
图1 A：不同物种WRKY48蛋白的系统进化树。B：云南杨、毛果杨、胡杨、巴西橡胶和木薯WRKY48蛋白氨基酸序列的多重比对。C：GUS染色结果。D：PyWRKY48在不同品系中的相对表达量。E：镉胁迫50天后各组织中PyWRKY48的相对表达水平。F：镉胁迫0~48 h期间杨树根部和叶片中PyWRKY48的动态表达量。G：PyWRKY48 在烟草中的亚细胞定位。
2. PyWRKY48过表达转基因杨的生物量和镉积累如表1所示，在镉处理和正常条件下，转基因杨的根、茎和叶的干重均高于WT。同时在镉胁迫下WT植物的生物量低于对照组，而转基因杨的生物量却有所增加。因此，可以推断PyWRKY48对杨树的生长具有正向调节作用。表2显示了WT和转基因杨树中的镉积累程度。转基因杨树根、茎、叶中镉含量均显著高于野生型，其中叶>茎>根。结果表明PyWRKY48的过表达增强了植株对镉的吸收和积累。表1 镉胁迫对杨树不同组织生物量的影响。![]()
表2 镉胁迫下杨树不同组织中镉的累积量![]()
3. PyWRKY48的过表达影响根结构和不同组织的镉积累在实验过程中，作者发现，PyWRKY48转基因杨树比野生型杨树有更多的侧根。侧根越多，越有利于吸收更多的镉离子。作者还使用显微镜观察了镉胁迫下野生型和转基因植物在不同组织中镉积累的差异。根切片染成深红色表明有更多的镉积累。可以看出，在根中心附近，转基因杨中镉的积累明显多于野生型。对叶片进行染色后，观察到叶片的叶脉和叶肉细胞积累了较多的镉，且转基因杨叶片中镉积累的面积比WT大（图2D）。实验结果进一步证明转基因杨树比野生型杨树表现出更多的镉积累。![]()
图2 PyWRKY48对杨树生物量、根系和镉积累的影响。B和C：过表达的PyWRKY48增加了侧根的数量。D：镉在根和叶中的定位。深红色标记了镉离子的位置。
4. PyWRKY48过表达增加了转基因杨树的光合色素含量为了观察PyWRKY48是否会提高光合色素的含量，作者对实验组和对照组的叶绿素和类胡萝卜素含量进行了测定。结果显示，无论是在对照还是镉处理组中，转基因植物的叶绿素和类胡萝卜素含量均高于WT植物（图3B）。此外，转基因植物的叶子比野生型植物的叶子更绿（图3C）。结果表明过表达PyWRKY48可以提高转基因杨的光合色素。![]()
图3 镉胁迫对杨树光合色素的影响。A：杨树叶片中的叶绿素含量。B：杨树叶片中类胡萝卜素含量。C：镉胁迫下杨树的叶片颜色和RGB值。
5.过表达PyWRKY48对GSH、PCs、GST和过氧化氢的影响为了了解PyWRKY48在杨树中响应镉胁迫的机制，作者测定了根和叶中谷胱甘肽（GSH）、PCs、谷胱甘肽转移酶（GST）和过氧化氢的含量。图4A和B显示，在镉处理下，转基因杨根和叶中的GSH、PCs含量和GST活性都显著高于WT植株。镉胁迫诱导的氧化程度可以根据植物中过氧化氢的含量来确定。在镉胁迫下，转基因杨树的叶和根中的过氧化氢含量低于WT（图4E和F）。因此，PyWRKY48过表达降低了镉胁迫下植株的氧化程度。
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图4 镉胁迫对杨树生理性状的影响。A-B：杨树根和叶中GSH和PCs的含量。C-D：杨树根和叶中的GST活性。E-F：杨树根和叶中的过氧化氢含量。
为了确定PyWRKY48在杨树中响应镉胁迫的调节机制，作者分析了镉胁迫下PyWRKY48过表达和WT杨树之间的DEG数量（图5A）。镉胁迫下，转基因杨根部DEGs少于WT杨树，其中1872个DEGs上调，2785个DEGs下调，而叶中的DEGs多于WT杨树，其中有4556个DEG上调，5027个DEG下调。另外，从韦恩图可以看出，在镉胁迫下，499个DEGs共同调控WT和过表达杨树的根和叶（图5B）。作者发现一些DEGs是根或叶特有的。进行DEG聚类分析来比较PyWRKY48过表达和WT杨树（图5C和D），结果显示WT和转基因植物根部之间有2074个DEG，叶子中有4325个DEG。为了研究镉胁迫下WT和PyWRKY48过表达系之间涉及DEG的代谢途径，进行了KEGG通路分析（图5E）。基于KEGG分析，镉胁迫组与对照组相比，PyWRKY48过表达株系的叶中发现了更多的DEG，其中458个DEG被归类为碳水化合物代谢。此外，还有DEG分别参与运输和分解代谢、信号转导、应答和修复、脂质代谢、氨基酸代谢、其他次生代谢物的生物合成和环境适应。结果表明过表达的PyWRKY48可以诱导更多的DEGs，并在杨树对镉胁迫的响应中发挥重要的调节功能。此外，KEGG分析表明，镉胁迫下根部2074个DEG和叶4325个DEG所涉及的通路存在显著差异。在根部，DEGs主要富集在植物激素信号转导、苯丙素生物合成、淀粉和蔗糖代谢、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号通路、糖酵解或糖异生、谷胱甘肽代谢等方面。然而，在叶子中，DEG主要富集在核糖体、碳代谢、糖酵解或糖异生、光合作用、类黄酮生物合成和磷酸戊糖途径中（图5F-G）![]()
图5 与过表达系和WT系相比，与镉胁迫相关的DEG的表达模式。A：与镉胁迫相关的上调和下调基因的图形表示。B：DEG的韦恩分析。C-D：根和叶中DEG的聚类分析。E：根和叶中DEG的KEGG富集分析。F-G：将镉胁迫下的过表达系或WT系与其对照（无镉处理）进行比较，对根和叶中与镉胁迫相关的DEG进行KEGG富集分析。
8.镉胁迫响应基因与组织特异性生理性状的相关性分析为了探索PyWRKY48引起的转录水平变化，作者在根部中选取了499个DEG用于基因共表达网络分析（WGCNA）。通过测定每个模块中的基因数量，发现在13~130个范围内，gray模块中有3个DEG，表明这3个基因与其他基因模块没有共表达。WGCNA分析显示四个模块与镉含量呈正相关，包括：black、brown、green-yellow和pink模块。Pink模块与PC含量呈正相关。Brown模块、green-yellow模块和pink模块与过氧化氢含量呈正相关。在叶片中鉴定出九个不同的共表达模块（图6B），6个模块与叶片生理性状显著相关，其中4个模块（magenta, green, blue, and tur quoise）与镉含量呈正相关。Green模块与类胡萝卜素和GSH含量呈正相关，而magenta模块与过氧化氢含量呈正相关。基因共表达网络结果获得了杨树根和叶中的关键DEG和核心生理过程，揭示了基因表达与生理特征之间的正相关关系。9.镉胁迫下杨树根和叶中PyWRKY48调节差异表达基因分析为了确定野生型和转基因杨树之间这499个DEG所涉及的不同KEGG途径，作者使用了基因表达量（TPM值）。结合DEG的功能分析，选择27个DEG来创建热图（图6C）。这些蛋白被分为六类，包括ABC转运蛋白、叶绿体蛋白、树皮储存蛋白、转运蛋白、重金属相关蛋白等。最显著富集的是“叶绿体蛋白”，有10个相关DEG。这10个DEG参与了叶室发育、保护植物免受光氧化、电子传递等。还有四个DEG被分为“ABC转运蛋白”，负责ATP结合、细胞分裂素转运和植物生长。TPM值最高的三个DEG被归类为“树皮储存蛋白”。此外，两个DEG（PaNPF2.11和PaATX1）在“转运蛋白”类别中得到富集。PaNPF2.11参与物质从根部到木质部的运输，PaATX1参与铜离子的稳态。有两个DEG（PaHIPP16和PaHIPP47）是“重金属结合蛋白”。最后，六个基因分别与钙结合(PaCML29)、细胞壁结构(PaGRP0.9)、应激适应(PaPHOS32)和酶活性(PaAtlg74460、PaPYL4和PaPER3)相关。27个DEG中，转基因植株根和叶中有14个基因的TPM值高于WT植株，其中转基因植株的根和叶分别有8个和5个基因的TPM值高于WT植株。![]()
图6 镉胁迫下转基因杨及WT品系根部和叶片DEG的热图分析。A-B：杨树根和叶中DEG的基因共表达网络分析(WGCNA)。C：将镉胁迫下的过表达品系(OE-67)或WT品系与其对照（无镉处理）进行比较时，对根和叶中鉴定出的DEG进行热图分析。
10.镉胁迫下PyWRKY48过表达杨树的关键驱动分析(KDA)基于基因注释和KEGG通路分析的结果，利用Key Driver分析了由499个DEG组成的调控网络。因此，可以通过数据库搜索来识别其他调控元件，而这些调控元件可用于转基因杨树中镉积累的辅助分析。如图7所示，共有10个关键驱动因子（KD），包含8个基因，分别是PaCHLN、PaPHT1-3、PaMTP10、PaABCC3、PaPELPK1、PaLAC12、非特异性脂质转移蛋白和碱性7S球蛋白2。PaMTP10、PaABCC3和PaPELPK1基因分别编码金属耐受蛋白、ABC转运蛋白和植物激素，是值得特别关注的关键节点基因。同时，这些基因的发现可以为进一步的研究奠定基础。![]()
图7 将镉胁迫下的WT和过表达品系(OE-67)品系与其对照进行比较时，关于根和叶中DEG的关键驱动分析(KDA)。
=== 总结 ===
结合实验数据可以得出，过表达PyWRKY48的杨树品系能够修复镉污染土壤。本研究初步阐明了PyWRKY48增强杨树镉吸收、积累和耐受性的分子机制。PyWRKY48通过上调ABC转运蛋白(PaABC)、重金属结合蛋白(PaHIPP)以及参与木质部运输和装载的蛋白质(PaNPF和PaBSP)来增强转基因杨树中镉的积累，通过上调细胞壁蛋白结构(PaGRP)、酶活性(PaPER)和促进其对环境的适应性(PaPHOS)来增强转基因杨树对镉胁迫的耐受性。同时，PyWRKY48通过增加叶绿素和类胡萝卜素含量来改善植物光合作用，从而促进杨树生长。此外，镉胁迫下转基因植物GSH/PCs含量和GST活性的增加也有利于镉的积累。因此，本研究为今后进一步探索PyWRKY48基因的下游靶点以及PyWRKY48调控的杨树响应镉胁迫的特定网络奠定了基础。
期刊：International Journal of Biological Macromolecules------------------------------原文链接（点击“阅读原文”）
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