2024年5月，西南大学研究团队在期刊The Plant Journal发表了一篇题为Transcription factor OsNF-YC1 regulates grain size by coordinating the transcriptional activation of OsMADS1 in Oryza sativa L.的研究论文。作者创制出转基因材料，以及利用酵母双杂交、BiFC和pull-down实验揭示了水稻中一个由OsNF-YC1-OsMADS1-OsMADS55模块控制的潜在的籽粒大小调控途径。![]()
=== 研究背景 ===
NF-Y转录因子家族是一种由NF-YA、NF-YB和NF-YC亚基组成的三聚体蛋白质，已有研究表明其在植物界具有不同的功能，包括调节水稻抽穗、抗逆性、谷粒品质等方面。OsNF-YCs是重要的转录因子，通常与其他蛋白相互作用在水稻中发挥多种作用，最近研究表明OsNF-YC2和OsNF-YC4影响了抽穗时期、OsNF-YC10在水稻发育后期的胚乳和颖壳中高表达，并通过影响细胞增殖来调节粒宽、OsNF-YC12协调多条途径调控水稻胚乳发育和种子贮藏物质的积累等，但在水稻种子生长方面的很多调节机制尚不清楚。# 思维导图：
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=== 研究结果 ===
1. OsNF-YC1通过影响细胞增殖和扩张来调节籽粒大小
已有研究报道OsNF-YC1参与HAP复合体的形成，并可能在水稻生长的各个方面发挥功能，为了阐明OsNF-YC1的功能，作者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了提前终止的osnf-yc1-g和osnf-yc1-t的基因敲除突变体 (图1a, b)。种植后观察发现，与野生型相比，osnf-yc1-g/t系在营养生长期没有表现出任何显著的差异，在成熟期，osnf-yc1-g/t植株的籽粒长度没有变化，但与野生型植株相比，敲除植株粒宽和粒厚都会减少而导致其籽粒更细小 (图2a-i)。为了进一步研究OsNF-YC1的功能，作者得到了osnf-yc1-g的互补系，种植后发现互补系中的表型与野生型一致，这些结果表明OsNF-YC1调控水稻的籽粒大小。为了在细胞学水平上研究籽粒较小的性状，作者对开花前的颖片进行切片后观察发现osnf-yc1-g/t颖片外的细胞数量少于野生型，细胞本身也较小，较窄，表明osnf-yc1中较小的籽粒可能是由于细胞较少和较小造成的。之后作者检测了调控细胞周期的基因的表达，发现CDC2Os-1、CDKB1、CYCA1;1、CYCA2;1 and CYCD3;1在osnf-yc1-g/t植物中显著下调，表明细胞数量减少可能是由于促进细胞增殖的基因表达减少所致。因此，这些数据表明OsNF-YC1可能通过影响细胞增殖扩张来调节籽粒大小。为了进一步了解OsNF-YC1在调节水稻籽粒大小中的作用，作者也得到OsNF-YC1-RNAi转基因株系，发现其与突变体产生的表型类似 (图3d-g)。![]()
图1. OsNF-YC1的进化分析和CRISPR突变体的遗传和蛋白质分析。(a) CRISPR突变体的目标位置和遗传分析。CRISPR突变体osnf-yc1-g和osnf-yc1-t分别表现为G插入和T插入。(b) 野生型与OsNF-YC1突变体的蛋白质序列比较。OsNF-YC1的CBFD-NFYB-HMF结构域以蓝色标记。“*”表示终止密码子。(c) OsNF-YC1及其同源蛋白的系统发育树。![]()
图2. 野生型和osnf-yc1-g/t植物颖片的表型和农艺性状分析及细胞学观察。
(a-e) 野生型和osnf-yc1-g/t植株 (a) 株高、(b) 穗形态、(c) 粒宽、(d) 粒厚和 (e) 粒长的比较。(f-i) 野生型和osnf-yc1-g/t植株农艺性状的统计分析。(f-h) 粒宽、粒厚、粒长 (n=20)，(i) 千粒重 (n=6)。(j) 开花前野生型和osnf-yc1-g/t植株小穗外壳的比较。(k) 野生型和osnf-yc1-g/t植物的小穗外壳横截面。(l, m) 外实质层细胞数和细胞面积比较 (n=3)。(n-s) 扫描电子显微镜图像的外表面和内表面的野生型和osnf-yc1-g/t植物。(t-w) 野生型和osnf-yc1-g/t植株 (n=100) 内外颖片细胞长度和宽度的比较。图3. 转基因OsNF-YC1 RNAi品系的表型和农艺性状。
(a) 粒宽和 (b) 粒长在野生型和3个OsNF-YC1 RNAi系之间的差异比较。(c) 用实时荧光定量RT-qPCR (n=3) 检测OsNF-YC1在野生型和3个OsNF-YC1 RNAi系幼穗发育早期的表达水平。(d-f) 粒宽、粒厚和粒长 (n=20)。(g) 1000--粒重 (n=3)。野生型与3个OsNF-YC1 RNAi品系间重要产量性状的统计分析。2. OsNF-YC1定位于细胞核和细胞质，具有转录激活活性
为了确定OsNF-YC1蛋白在细胞中的定位，将带有GFP信号OsNF-YC1转化水稻原生质体和烟草细胞中，发现OsNF-YC1定位于细胞核和细胞质 (图4a)。为了评估突变对OsNF-YC1亚细胞定位的影响，作者将编辑的编码截短89个氨基酸的多肽的osnf-yc1-g/t与GFP融合，并在水稻原生质体中观察，发现OsNF-YC1-G/T也定位于细胞核和细胞质 (图4a)。接着为了分析OsNF-YC1的时空表达模式，作者用RT-qPCR在野生植物的根、茎、叶、鞘和圆锥花序中分析了OsNF-YC1的表达。结果表明，OsNF-YC1在根、茎、叶、鞘和圆锥花序中均有表达，幼穗中表达水平较高 (图4b)。同时，也获得了OsNF-YC1的启动子-GUS植株。对OsNF-YC1 GUS转基因株系进行了分析，在穗部观察到明显的GUS活性 (图S7C-E)。并且利用酵母双杂交 (Y2H) 系统和双荧光素酶报告实验证明了OsNF-YC1是一种具有转录激活活性的转录因子 (图4c和图S7F)。为了评估OsNF-YC1不同区域转录激活的差异，构建了具有CBFD-NFYB-HMF结构域不同成分的各种载体进行Y2H分析，结果表明，OsNF-YC1的CBFD-NFYB-HMF结构域在N-末端有较强的转录激活活性，在C-末端有较弱的转录激活活性，在CBFD-NFYB-HMF结构域没有转录激活活性 (图4c)。为了进一步评估这些截短的多肽的转录激活活性，将编码OsNF-YC1-G和OsNF-YC1-T的多肽序列分别与载体pGBKT7和GAL4BD融合，分别转化感受态酵母细胞和水稻原生质体。这些实验结果表明，OsNF-YC1-G/T保留了转录激活活性 (图4c和图S7F)。![]()
图4. OsNF-YC1的亚细胞定位、表达模式和转录活性。
(a) 在水稻原生质体中观察到OsNF-YC1的亚细胞定位。融合蛋白D53-mCherry作为核标记，特异性地定位于细胞核。(b) OsNF-YC1的时空表达模式。利用野生型植物的根、茎、叶、叶鞘和圆锥花序进行了表达分析。以ACTIN为对照，将野生型的表达水平设置为1 (n=3)。(c) OsNF-YC1在酵母中的转录活性分析。将OsNF-YC1的全长和一系列截短的cDNA片段克隆到pGBKT7载体中。数字表明了OsNF-YC1中的氨基酸位置。以空载体pGBKT7为阴性对照，pGBKT7-OsTB1为阳性对照。![]()
图S7. OsNF-YC1的亚细胞定位、GUS染色和转录活性。
A: OsNF-YC1在烟草中的亚细胞定位。B: 在p35S::OsNF-YC1- GFP转基因植株根细胞中观察到OsNF-YC1的亚细胞定位。C-E: OsNF-YC1-GUS转基因植物不同发育穗中GUS的组织学表达。F: OsNF-YC1在水稻原生质体中的转录活性分析。3. OsNF-YC1与转录因子OsMADS1互作
为了确定OsNF-YC1调节籽粒大小的分子机制，作者基于CBFDNFYB-HMF结构域筛选了OsNF-YC1相互作用蛋白的酵母文库，并鉴定了一个潜在的相互作用蛋白OsMADS1 (图5a)。进一步通过pull-down和BiFC实验证实了OsNF-YC1在体内和体外都能与OsMADS1相互作用 (图5b,c)。为了验证OsNF-YC1和OsMADS1的相互作用区域，作者构建了具有OsNF-YC1和OsMADS1不同区域的载体，并将这些载体用于Y2H分析，结果表明，OsNF-YC1与OsMADS1之间的相互作用依赖于CBFD-NFYB-HMF结构域，突变的OsNF-YC1-G/T蛋白由于缺乏该结构域而不能与OsMADS1相互作用，而OsMADS1中的MADSbox结构域对于其与OsNFYC1的相互作用至关重要 (图5a；图S8)。![]()
图5. OsNF-YC1与OsMADS1的相互作用。
(a) 在酵母双杂交试验中分析OsNF-YC1及其截短蛋白与OsMADS1的相互作用。(b) 通过GST pull-down检测到OsNF-YC1与OsMADS1相互作用。(c) 用BiFC法检测到OsNF-YC1与OsMADS1在烟草细胞核中的相互作用。![]()
图S8. OsNF-YC1和OsMADS1互作。
OsMADS1及其截断蛋白分别与OsMADS1-YC1结构域CBFD-NFYB-HMF在Y2H试验中的相互作用。M表示MADS结构域，I代表中间结构域，K代表类角蛋白结构域，C代表C端结构域。4. 与OsNF-YC1相互作用增强OsMADS1的转录激活活性
为了探讨OsNFYC1和OsMADS1之间的互作对水稻籽粒发育的影响，作者采用RT-qPCR方法检测了OsMADS1的转录水平，发下按OsMADS1在osnf-yc1-g/t植株中的表达与野生型没有显著差异 (图6a)。又通过蛋白质印迹发现OsMADS1的蛋白质水平没有发生变化 (图6b)，以及采用原位杂交方法发现在osnf-yc1-g/t植物的幼穗中OsMADS1没有明显的异位表达 (图6c)。已有研究报道OsMADS1的转录活性与水稻的籽粒大小和形状有关，因此，作者推测OsNF-YC1可能影响OsMADS1的转录激活活性，从而调控其下游基因的表达。为了证明这一假设，作者进行了瞬时转录活性测试，结果表明，当OsNF-YC1和OsMADS1互作时，OsMADS1的转录激活活性显著增强。此外，当向原生质体中添加osnf-yc1-g/t时，OsMADS1的转录激活活性没有改变 (图6d)。这表明OsNF-YC1可以通过直接相互作用增强OsMADS1的转录激活活性。OsMADS1已被报道直接调控下游基因的转录，如OsMADS17、OsMADS55、OsKANADI4、OsPIN1、OsHB4、OsETTIN2和OsARF9。因此，作者利用RT-qPCR技术研究了这些基因在osnf-yc1-g/t植物中的表达，发现OsMADS55在osnf-yc1-g/t中的表达显著下调。之后通过瞬时转录活性实验发现OsMADS55启动子驱动的Luc活性可被OsMADS1诱导，而OsMADS55启动子驱动的Luc活性不能被OsNF-Yc1直接诱导，OsNF-YC1和OsMADS1的共表达显著增强了OsMADS55启动子驱动的Luc活性，但当osnf-yc1-g/t和OsMADS1共表达时不发生变化 (图6f)。为了进一步证实这一观察结果，作者构建了OsMADS55-OE载体将其转化到osnf-yc1-t植物中，并获得了阳性转基因株系osnfyc1/OsMADS55-OE-1和osnf-yc1/OsMADS55-OE-2 (图7c)。观察表型发现，转osnf-yc1/OsMADS55-OE转基因株系的籽粒大小大于osnf-yc1-t植株，但仍小于野生型植株 (图7a, b)。这表明，在osnf-yc1突变体中过表达OsMADS55可以部分挽救减小的籽粒表型。同时，作者利用CRISPR-Cas9技术得到了基因敲除突变体osmads55，该突变植株表现出较小的籽粒和其他的与osnf-yc1-g/t相似的特征，这表明了OsNF-YC1增强了OsMADS1的转录激活活性，这两个基因共同调节下游基因的表达，如OsMADS55，影响籽粒大小。![]()
图6. OsMADS1与OsNF-YC1相互作用，增强OsMADS1的翻译激活活性。
(a) 用实时荧光定量RT-qPCR (n=3) 检测OsMADS1在野生型和osnf-yc1-g/t植物幼穗发育中的表达水平。(b) 用免疫印迹法测定野生型和osnf-yc1-g/t植物幼穗发育中OsMADS1的蛋白水平。(c) 在Sp4-Sp5、Sp6、Sp7和Sp8发育阶段，OsMADS1在野生型和osnf-yc1-g/t幼穗中的表达模式。(d) OsMADS1和OsNF-YC1之间的相互作用对OsMADS1翻译激活活性的影响。(e) 野生型和osnf-yc1-g/t植物幼穗发育中OsMADS1下游靶基因的表达水平。(f) OsNF-YC1和OsMADS1之间的相互作用促进了OsMADS55的表达。![]()
图7. osnf-yc1/OsMADS55-OE和osmads55植株的表型和农艺性状分析。
(a, b) 野生型、osnf-yc1-t和两个osnf-yc1/OsMADS55-OE品系的 (a) 粒宽和 (b) 粒长的比较。(c) 用实时荧光定量RT-qPCR (n=3) 检测了野生型osnf-yc1-t和两个osnf-yc1/OsMADS55-OE品系幼穗发育早期OsNF-YC1的表达水平。(d, e) 粒宽、粒厚 (n=20)，(f) 千粒重 (n=5)。(g) CRISPR突变体的目标位置和遗传分析。CRISPR突变体osmads55显示T插入。(h, i) 野生型和osmads55植株的 (h) 粒宽和 (i) 粒长的比较。(j-l) 粒宽、粒厚 (n=20)。
=== 总结 ===
综上所述，作者提出了一种决定籽粒大小发育的新途径，即OsNF-YC1与OsMADS1相互作用，增强其转录激活活性，并通过正向调节OsMADS55的表达来调节籽粒大小 (图8)。![]()
图8. 水稻OsNF-YC1-OsMADS1-OsMADS55可能的籽粒大小调控途径
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