2024年6月，Plant, Cell & Environment在线发表了浙江农林大学卢孟柱/张进教授课题组完成的题为“PagKNAT2/6b promotes shoot branching by attenuating auxin‐strigolactone signalling in poplar”的研究论文，揭示了一个新的分枝发育调控模块“PagKNAT2/6b-IAA-SL”即杨树KNOX基因家族成员PagKNAT2/6b响应顶端胁迫处理，并通过抑制生长素（IAA）合成基因YUC6a的表达减低植物体内IAA含量，而IAA含量的降低直接导致独角金内酯（SL）合成基因（MAX3与MAX4）的表达下降，进而降低SL含量促进分枝的发生。
=== 研究背景 ===
=== 研究结果 ===
1. IAA–SL通过抑制腋芽生长维持杨树的顶端优势
为确定生长素在杨树侧枝发生过程中的作用，首先通过各种可削弱IAA含量的顶端胁迫处理，随后将外源IAA施加于断头残端，发现IAA外施可直接抑制过多的分枝发生并保持较强的顶端优势（图S1B）。
图S1.顶端胁迫处理促进分枝发生。（A）不同顶端胁迫处理促进侧枝萌发。（B） 外施IAA于断头残端后抑制下部腋芽萌发。
为进一步探究IAA-SL通路在侧枝萌发中的作用，作者分析了SL关键限速基因PagMAX3、PagMAX4a、PagMAX4b和PagLBO在去顶后2小时及4小时后的组织表达特异性，发现其断头处理开始后2小时和4小时的表达水平显著下降（图S3A）。与此同时，在去顶后施加IAA的情况下，以上SL合成基因的表达量恢复至正常水平（图S3B）。由此可知，去顶后导致植物顶端IAA含量的降低直接导致SL合成基因表达量的下降，说明IAA可激活SL合成基因的表达维持顶端优势。
图S3. IAA激活SL合成基因的表达维持顶端优势。（A-B） 对去顶处理后的根茎混合物中SL合成基因的表达进行了评估。（C-D） 培养基中添加IAA与NPA生长一个月后分析SL合成基因的表达。
2. PagKNAT2/6b在顶端与腋芽表达并响应顶端胁迫处理
为检验PagKNAT2/6b在茎顶端损伤胁迫后的分枝发生过程中的功能，首先通过qRT‐PCR（图1A）和GUS染色（图1B-C）检测了PagKNAT2/6b在不同组织中的表达模式。作者发现PagKNAT2/6b主要在腋芽与顶端分生组织的中心区域表达。随后，作者分析了PagKNAT2/6b对茎顶端胁迫的响应，如去顶和顶端压力处理（图1D）。结果表明，PagKNAT2/6b在茎尖损伤处理2-4 h后表达量达到峰值，随后表达量下降，并保持在较低水平（图1E-F）。
图1. PagKNAT2/6b在腋芽中高表达且响应顶端胁迫处理。（A）PagKNAT2/6b在不同组织中的表达分析。（B-C）为ProPagKNAT2/6b::GUS转基因株系GUS染色后进行SAM和AB切片。（D-F）在去顶与顶端压力处理后，取靠近顶部的4个腋芽分析PagKNAT2/6b的表达变化。
为了进一步验证PagKNAT2/6b在响应顶端胁迫处理后的生物学功能，作者创制了PagKNAT2/6过表达、反义抑制（anti2、anti3）和突变体植株并进行去顶处理与顶端压力处理，结果表明过表达株系分枝数目多于野生型植株（NT）（图2A），而突变体的分枝数目（图3）显著少于NT。以上结果表明PagKNAT2/6b异常表达影响茎顶端胁迫处理后分枝的发生。
图2. PagKNAT2/6b在顶端胁迫处理下促进分枝发生。（A-B）去顶处理后分枝数目观察分析；（C-D）顶端压力胁迫处理后分枝数目的观察分析。
图3. Pagknat2/6b突变体鉴定及突变体顶端胁迫处理。（A）PagKNAT2/6b基因结构及靶序列示意图。（B）knat2/6b30和knat2/6b48编辑形式。（C-D）分别为Pagknat2/6b突变体去顶与顶端压力处理。
3. 过表达PagKNAT2/6b减少IAA与SL激素的积累
为验证PagKNAT2/6b OE株系分枝的变化是否是由的IAA和SL含量变化所引起的，对NT和PagKNAT2/6 OE株系根的SL和茎尖的IAA含量进行了分析，发现OE5和OE7株系的内源性IAA和2′-epi-orobanul（内源SL含量）水平分别比NT低73.8%、38.6%和77.7%、72.2%（图4D）。随后，作者通过外源激素进一步分析合成的SL类似物GR24是否可以回补PagKNAT2/6b OE株系的分枝表型，结果表明GR24处理降低了腋芽发芽率。由此可知，PagKNAT2/6b OE株系分枝增多的表型是由内源性SLs水平的降低引起的。作者分析了IAA处理后的PagKNAT2/6b OE植株与对照组的分枝数无显著差异（图4F），说明去顶处理后外源IAA处理使PagKNAT2/6b OE植株的分枝数恢复到NT的水平。综上可知，PagKNAT2/6b OE杨树中IAA和SL含量的下调导致分枝数目增加。
图4. PagKNAT2/6b过表达转基因杨树中IAA和SL含量降低。（A-C）分枝表型。（D）根中内源SL和茎顶端IAA的含量。（E-F）SL类似物GR24或IAA外施处理对分枝发生的影响。
4.PagKNAT2/6b直接抑制PagYUC6a的表达
考虑到IAA与SL在PagKNAT2/6b OE杨树表现出含量的下调，所以分析了IAA与SL合成基因的表达。与NT相比，PagKNAT2/6b OE系中SL合成基因的表达明显受到抑制。与此同时，茎尖组织中参与IAA生物合成的PagYUC基因的表达发生变化，其中PagYUC6a、PagYUC10和PagYUC11a在PagKNAT2/6b OE系中显著下调，而在PagKNAT2/6b反义抑制株系中显著上调。已有研究表明，YUC6是茎尖生长素合成的关键因子，为此作者推测PagYUC6a可能是PagKNAT2/6b的关键下游靶基因。为验证以上推测，作者在Pagknat2/6b突变体的SAMs中验证了PagYUC6a的表达水平，发现这些基因在Pagknat2/6b突变体中表达上调（图5A）。随后，作者借助Lau-LUC实验发现PagKNAT2/6b抑制PagYUC6a表达（图5B）。ChIP‐Seq数据结果表明，PagYUC6的启动子区富集了一条57bp的片段（位于ATG上游-288~-338bp），ChIP-PCR进一步证实该片段在免疫沉淀样品中高度富集（图5C）。最后，作者通过EMSA和DAP‐Seq技术对PagYUC6a启动子57bp区域的亲和分析进一步显示，PagKNAT2/6b在体外不能结合PagYUC6a的启动子区域。因此，作者推测PagKNAT2/6b可能通过与其他蛋白的相互作用抑制PagYUC6a的表达。为了证实这一假设，作者使用Co-IP获得的PagKNAT2/6b蛋白及其相互作用蛋白与标记的57-bp启动子探针混合进行EMSA。正如预期该复合物能够结合PagYUC6a的57bp启动子序列（图5D）。综上所述，PagKNAT2/6b在体内可以直接结合PagYUC6a启动子并抑制其表达，从而降低茎尖中IAA的含量。
图5.PagKNAT2/6b直接抑制PagYUC6a的表达。（A）NT和Pagknat2/6b突变体（Pagknat2/6b 30和Pagknat2/6b 48）SAM中PagYUC6a的相对表达量。（B）LUC/REN活性检测，验证PagKNAT2/6b抑制PagYUC6a的转录。（C）ChIP‐PCR分析显示PagKNAT2/6b与PagYUC6a启动子结合。（D）EMSA分析。
5. PagKNAT2/6b和PagYUC6调控模块影响杨树分枝发育
为了证实PagYUC6在分枝中的作用，作者创制了PagYUC6过表达的杨树，对PagYUC6a过表达的株系进行了去顶与压力胁迫处理，通过统计分析分枝的数量（图6B,C），发现PagYUC6过表达的杨树的分枝数量显著少于NT。
图6.PagYUC6a过表达增强了杨树的顶端优势性。（A）左侧为PagYUC6a OE株系的表型，右侧为qRT‐PCR表达分析。（B）PagYUC6a OE和NT植物的顶端压力处理。（C）PagYUC6a OE和NT植株的去顶处理。
与此同时，作者在PagKNAT2/6b OE背景下创制了过表达PagYUC6a的转基因植株（PagYUC6a OE/PagKNAT2/6b OE），并选择3个基因表达水平不同的株系（OE1和OE2）进行压顶处理（图7B）和去顶处理（图7C）。正如预期的那样，PagYUC6a OE/PagKNAT2/6b OE转基因杨树不再产生过多的分枝（图7D）。以上结果表明PagKNAT2/6b负调控PagYUC6a的表达进而通过IAA-SL途径影响分枝发育。
图7.PagKNAT2/6b OE背景下过表达PagYUC6a回补分枝表型。（A）PagYUC6a OE/PagKNAT2/6b OE株系的鉴定。（B）NT、PagKNAT2/6b OE（OE5和OE7）和PagYUC6a OE/PagKNAT2/6b OE（OE1和OE2）表型。（C-D）PagYUC6a OE/PagKNAT2/6b OE进行顶端压力处理与去顶处理。
=== 总结 ===
综上所述，在正常生长条件下PagKNAT2/6b通过调节IAA合成基因PagYUC6a的表达来维持SAM中正常的IAA含量；当茎尖受到生物或非生物胁迫损伤时，PagKNAT2/6b被激活并抑制IAA合成基因PagYUC6a的表达通过IAA-SL途径促进腋芽萌发进而增加分枝发生（图8）。
图 8. PagKNAT2/6b在分枝过程中的调控网络示意图。
期刊：Plant cell and environment
投稿日期：2024.1.31
接收日期：2024.4.15
发表日期：2024.5.22
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评述：宋铄
校对：郭雨
编辑：吴凤霞
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