2024年6月，中国林科院林木遗传育种国家重点实验室李全梓研究员团队在期刊Plant Science上发表了一篇题为C2H2 zinc finger protein PagIDD15A regulates secondary wall thickening and lignin biosynthesis in poplar的研究论文。作者在银腺杨 (P. alba × P. glandulosa) 中鉴定出一个转录因子PagIDD15A，属于IDD型C2H2-ZFP。在RNAi转基因杨树中，对PagIDD15A在木材形成过程中的功能进行了表征，表明PagIDD15A在木材形成过程中是次生壁增厚的调节因子。![]()
木材的产生在很大程度上取决于形成层细胞的增殖活性，而木质部细胞的次生细胞壁 (SCW) 的增厚决定了木材的性质。SCW的形成涉及木质素、纤维素和半纤维素的生物合成及其在细胞壁中的沉积。对SCW生物合成的调控进行了广泛的研究，已经确定了很多调控木质素、纤维素和纤维素半生物合成的转录因子 (TFs)。IDD ZFPs是植物特异性的TFs，属于C2H2锌指蛋白的一个亚家族。但IDD基因家族在杨树中尚未得到广泛的研究，也没有关于IDD基因调控木材形成的报道。# 思维导图：
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序列分析结果显示PagIDD15A具有3个C2H2锌指结构域，利用PagIDD15A和16个拟南芥IDD家族成员的蛋白序列构建系统发育树和分析蛋白结构域 (图1)，由图可知PagIDD15A是AtIDD15的同源蛋白。除AtIDD3和AtIDD8包含2个乙炔锌指结构域外，IDD15A和其他AtIDD蛋白都包含3个乙炔锌指结构域 (图1)，说明不同物种间IDD蛋白的结构是保守的。![]()
图1. PagIDD15A和拟南芥IDD蛋白的蛋白结构域分析。
2. PagIDD15A在杨树的韧皮部和分化木质部中表达
作者先通过AspWood检测了杨树IDD15A基因在欧洲山杨 (P. tremula) 茎中的表达模式。PtIDD15A基因在木质部和韧皮部表达量较高，而在形成层表达量相对较低 (图2A)。进一步通过RT-qPCR来探究PagIDD15在银腺杨中的表达模式。结果显示，PagIDD15A在茎尖中表达量最高，在韧皮部和分化木质部中表达量较高，在成熟叶片中表达量较低 (图2B)，表明其在茎尖和木材形成过程中具有潜在作用。作者通过RNA原位杂交的方法来明确PagIDD15A在银腺杨中的表达模式，与阴性对照相比，在韧皮部纤维细胞检测到强信号，分化木质部检测到较弱信号 (图2C)。PagIDD15A可能在韧皮部纤维和分化的木质部这些细胞中发挥作用，比如细胞壁的增厚。![]()
图2. PagIDD15A在银腺杨不同组织中的表达模式A. AspWood预测的杨树IDD15A基因在茎韧皮部到木质部的表达模式。该图大致可分为韧皮部 (Ph)、形成层区 (Ca)、扩张木质部区和次生细胞壁形成区四个部分。B. RT-qPCR分析1月龄银腺杨的茎尖、叶、韧皮部和分化木质部的表达丰度。Apex：茎尖；Le：展开的叶片；Ph：韧皮部；Xy：正在分化的木质部。采用单因素方差分析进行显著性分析 (*：P < 0.5；**：P < 0.01；***：P < 0.001）。C. 银腺杨第7节间茎中PagIDD15A的RNA原位杂交。左侧，与反义探针 (AS) 杂交。对，与正义探针 (S) 杂交。xy：木质部，ph：韧皮部。标尺 = 50 μm。3. 沉默PagIDD15A抑制SCW的生物合成和木质部的发育
为了研究PagIDD15A在杨树生长中的作用，作者创制了PagIDD15A-RNAi转基因株系，选择3个与WT相比PagIDD15A基因表达减少多的株系 (RNAi-15, RNAi-16, RNAi-17) 进行细胞学观察和细胞壁组成分析。选取3月龄PagIDD15A-RNAi转基因植株和野生型植株第7节间茎进行横切，并在显微镜下观察。TBO染色显示，与WT相比，PagIDD15A-RNAi转基因植株次生木质部和韧皮部纤维的发育明显受到抑制 (图3A)。统计分析发现，PagIDD15A-RNAi转基因植株的木质部宽度减少了20.0 %以上 (图3C)。进一步对茎段切片进行了扫描电镜的观察 (图3B)。数据统计结果发现，与WT相比，PagIDD15A-RNAi转基因植株的导管细胞和纤维细胞壁厚均显著降低 (图3D，E)；形成层层数显著减少 (图3F)，木质素含量显著下降 (图3G)。![]()
图3. PagIDD15A-RNAi转基因植株的细胞学观察。A.野生型 (WT) 和3个PagIDD15A-RNAi转基因株系第7节间的茎横截面TBO染色的细胞学观察。B. WT、RNAi-15、RNAi-16和RNAi-17第8节间的茎横断面的扫描电镜观察。Bars = 50 μm。对WT和3个RNAi转基因株系的木质部宽度 (C)、导管壁厚度 (D)、纤维细胞壁厚度 (E)和形成层细胞层数 (F) 进行统计分析。G. WT和3个RNAi转基因木材中的木质素含量。
4. RNA-seq分析表明PagIDD15A的RNAi基因沉默影响了杨树的次生生长
为了阐明PagIDD15A-RNAi转基因植株表型的遗传基础，作者将3个月龄转基因植株的第7，8节间的茎段进行了高通量基因表达谱分析 (RNA-seq)。结果显示，3个RNAi株系中分别有6133、17、207和1099个DEGs，3个株系共有的有404个DEGs (图S3A)。火山图显示，PagIDD15A-RNAi转基因植株茎中258个DEGs表达上调，146个DEGs表达下调 (图S3B)。GO和KEGG分析均显示，PagIDD15A的基因沉默影响了茎的次生生长，包括SCW的形成 (图S3C，图S3D)。![]()
图S3. PagIDD15A-RNAi转基因植株茎的RNA-seq分析
A. 三个PagIDD15A-RNAi转基因株系 (RNAi-15、RNAi-16和RNAi-17) 的DEGs的维恩图。B. DEGs的火山图显示下调基因 (蓝色) 和上调基因 (红色)。C. GO富集气泡图。D. KEGG通路气泡图。气泡的颜色从紫色到红色表示-log10 (pvalue) 值从小到大。气泡的大小代表了富集基因的数量。5. PagIDD15A调控与SCW形成相关的基因的表达
RNA-seq分析显示，PagIDD15A-RNAi转基因植株分化木质部中有387个基因表达上调，878个基因表达下调 (图4A，B)，对PagIDD15A-RNAi转基因植物分化木质部的GO富集分析，发现转基因植物茎中的富集途径与细胞壁有关。包括植物型SCW形成 (GO：0009834)、细胞壁多糖代谢过程 (GO：0010383)、细胞壁组装 (GO：0070726)、细胞壁组织 (GO：0071555)、细胞壁生物发生 (GO：0042546)等 (图4C)。KEGG分析表明，次生代谢物 (ko00940) 和苯丙氨酸途径 (ko00360) 的生物合成被富集 (图4D)。与茎段RNA-seq的结果一致，PagIDD15A-RNAi转基因植株分化木质部的GO和KEGG分析表明，PagIDD15A的沉默影响了茎的次生生长。![]()
图4. PagIDD15A-RNAi转基因植株分化木质部中差异表达基因的RNA-seq分析。
A. 三个PagIDD15A-RNAi转基因株系 (RNAi-15、RNAi-16和RNAi-17) 的DEGs的维恩图。B. DEGs的火山图显示下调基因 (蓝色) 和上调基因 (红色)。C. GO富集气泡图。D. KEGG通路气泡图。气泡的颜色从紫色到红色表示-log10 (pvalue) 值从小到大。气泡的大小代表了富集基因的数量。
作者进一步检测了木质素、纤维素和半纤维素生物合成途径中编码酶的基因的表达，包括5个纤维素合成酶基因 (PagCesA4, CesA7-A, Ces7-B, CesA8-A, CesA8-B)，20个木质素单体生物合成途径酶基因 (PagPAL1, PAL2, PLA3, PAL4, C4H1/2, C3H3, 4CL3, HCT1/6, CSE1/2, CCoAOMT1/2/3, CCR2, OMT2, CAld5H1/2, CAD1)，15个编码木材中半纤维素的主要成分木聚糖的生物合成的基因 (PagGT43A, GT43B, GT43C, IRX10-1, IRX10-2, IRX10-L-A1, PARVUS-2, GT8D2, FRA8, GUX2, GXM1, GXM2, IRX15-L)。RNA-seq结果显示，其中PagPAL1、PagCCR2、PagCCoAOMT1、PagIRX8和PagIRX15在PagIDD15A-RNAi转基因植株分化木质部中表达下调 (图5A)，这与RT-qPCR的结果相一致 (图5B)。热图显示21个TF基因的表达水平变化，除PagWRKY12、PagMYB134和PagMYB136上调外，其他在PagIDD15A-RNAi转基因植株分化木质部中表达均下调 (图5C，D)。PagMYC4、PagMYB10、PagWRKY12、PagNAC73分别是AtMYC4、AtMYB103、AtWRKY12、AtSND2的同源基因，而AtMYC4、AtMYB103、AtWRKY12和AtSND2已被鉴定为SCW形成过程中的调节因子。
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图5. PagIDD15A-RNAi转基因植株分化木质部的RNA-seq分析。
A. 热图显示了WT和3个RNAi转基因株系分化木质部中木质素、木聚糖和纤维素生物合成相关基因的表达水平。红色和蓝色分别代表较高和较低的基因表达水平。B. RT-qPCR证实了WT、RNAi-15和RNAi-16和RNAi-17中PagPAL1、PagCCoAOMT1、PagIRX8和PagIRX15的下调。C. 热图显示了TFs的表达水平，包括4个MYBs，2个MYCs，5个NACs，9个WRKYs和VND6-B2。D. RT-qPCR证实了RNAi转基因植物分化木质部中PagVND6-B2、MYB203和MYC4的下调和PagWRKY12的上调。 (* P < 0.05；*** P < 0.001)。6. PagIDD15A调控细胞增殖相关基因的表达
作者刮取含有形成层区域的茎的韧皮部侧，并采用RT-qPCR检测韧皮部-形成层组织中形成层细胞增殖相关基因的表达。PagAPL, PagNAC45, PagSEOB, PagCslA9, PagCLE45, PagBAM3, PagBAM3, PagCesA4, PagCes7-A, PagSCR, PagSHR, PagWOX8, PagCLV2, CKS2和CYCD3；1在PagIDD15A敲除转基因植株的韧皮部-形成层中表达下调。而PagSMR4和PagCDKG2则表达上调 (图6)。PagCesA4和PagCesA7-A的下调可能是导致韧皮部纤维壁厚减少的原因。其他基因与细胞增殖相关，支持PagIDD15A在调节形成层活性中发挥作用的推测。![]()
图6. RT-qPCR分析3个PagIDD15A-RNAi株系和野生型植株韧皮部形成层的基因表达水平。
作者利用WGCNA研究在木材形成过程中与PagIDD15A共表达并可能相互作用的蛋白。结果显示，有15个基因与PagIDD15A具有较强的基因共表达关系。其中，有14个基因在PagIDD15A-RNAi转基因植物的分化木质部中被下调，表明PagIDD15A可能直接调控这14个基因。并且，PagXTH15和PagEXLA1在表达上与PagIDD15A的相似性最高。6个基因 (PagXTH15、EXLA1、EXL5、XGT、XTR6和XXT1) 编码了可能参与细胞扩张的细胞壁修饰酶基因，这些基因在转基因植物分化木质部中被下调，说明PagIDD15A可能通过这些细胞壁修饰酶基因参与了细胞的分化。
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图7. 共表达网络图
网络图显示15个蛋白与PagIDD15A的基因表达模式一致，这15个蛋白包括PagXTH15、EXLA1、CCoAOMT1、CLE45、CeEsA4、EX070A2、MYC4、WRKY12、WRKY41、WRKY53、EXL5、XGT、XTR6、XXT1和NAC14。PagXTH15和PagEXLA1与PagIDD15A的表达模式相似性最高。
PagIDD15A是一种IDD型C2H2锌指蛋白，其基因在茎尖、幼叶和茎中表达。通过RNAi下调PagIDD15A可抑制木质部发育和SCW增厚。RNA-seq分析表明，PagIDD15A可能通过木质素生物合成酶基因 (PagPAL1、PagCCR2和PagCCoAOMT1) 和调控SCW生物合成的TF基因 (PagVND6-B2、PagMYB10、PagMYC4和PagWRKY12) 调控SCW的生物合成。PagIDD15A可能通过与细胞增殖相关的基因调节形成层活性，包括PagSHR、PagSCR、PagCYCD3;1和PagSMR4。
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