*仅供医学专业人士参考
发表杂志：Molecular Cancer
影响因子：IF=27.7
发表日期：2024.05.07
背景及目的：
非小细胞肺癌（NSCLC）是癌症最常见的类型，但超过70%的患者在诊断时已经处于局部晚期或转移阶段，这剥夺了他们进行外科治疗的机会，使其成为全球癌症相关死亡的主要原因。随着对肺癌基因分型研究的深入和分子靶向治疗的快速发展，靶向治疗已成为驱动基因突变（如EGFR和ALK）的晚期NSCLC患者的标准一线治疗。靶向治疗开创了NSCLC诊断和治疗的精准医学时代。Osimertinib是第三代EGFR TKI，有效靶向EGFR突变和T790M耐药性突变。FLAURA试验证明，这是EGFR阳性NSCLC患者的首选一线治疗方法。然而，奥西替尼有反应的患者的中位无进展生存期约为18.9个月，在二线治疗后，他们通常在约10个月后出现耐药性。尽管靶向治疗取得了初步成功，但奥西替尼耐药性仍然是一个重大挑战。各种已知机制包括EGFR突变（G719X、G796X、C797S）和野生型EGFR扩增。EGFR非依赖性因素，如组织学变化、替代途径（c-Met、HER2扩增、IGF1R激活）、NRAS/KRAS突变和致癌融合基因（RET、ALK、BRAF）也起作用。尽管如此，大约40-50%的抵抗机制仍不清楚。了解奥西替尼的耐药性对于改善治疗和患者预后至关重要。
环状核糖核酸（circRNAs）是一种独特的具有闭环的核糖核酸分子，由前信使核糖核酸的反向剪接形成。最初被视为剪接错误，circRNAs现在被认为是重要的基因表达调控因子。功能性circRNAs最初被发现能有效地吸收microRNA，从而在转录后调节下游靶基因。它们还可以作为miRNA的贮存器或载体。小脑变性相关蛋白（CDR1as）（也称为CiRS-7）的发现证实了这一现象，为人们理解circRNA可以作为内源性RNA（ceRNA）与60多个miRNA结合位点竞争打开了大门。随后的研究进一步证实了circRNA作为ceRNA或miRNA海绵的作用。circRNAs的调节也将传统的miRNA→mRNA→蛋白质模型转变为新的circRNA→miRNA→mRNA→蛋白质的调节模型。在这个新的调控模型中，circRNA使用miRNA反应元件（MRE）作为一种语言相互交流，竞争调节共享相同MRE的其他miRNA的表达。单个miRNA可以反过来调节多个mRNA的表达水平，单个基因可以同时被多个miRNA调节，从而形成一个巨大的相互连接的调节网络，在转录后水平调节基因表达。这种网络影响各种疾病的发生、发展和进展。目前的研究表明，环状RNA（circRNAs）在非小细胞肺癌（NSCLC）中表现出异常表达，并与肿瘤增殖、侵袭和转移等过程密切相关。一些circRNA显著上调或下调，在癌症发展过程中对基因表达的调节起着重要作用。此外，circRNAs还参与调节NSCLC对化疗和放疗的耐药性。在EGFR-TKIs治疗的背景下，circRNAs也与耐药性的发展有关。值得注意的是，在EGFR-TKIs耐药患者中，某些circRNA表现出显著的上调。这些circRNA可能通过调节EGFR通路和其他关键信号通路影响药物的有效性，导致EGFR-TKIs治疗的失败。总之，circRNAs在癌症的发生、发展、化疗耐药性和EGFR-TKI耐药性中起着至关重要的调节作用。深入研究circRNAs在NSCLC中的功能和调节机制，可以揭示癌症发生和耐药的分子基础，为NSCLC的诊断和治疗提供新的策略和靶点，为患者的预后和生存提供希望。然而，circRNAs与非小细胞肺癌中奥西替尼耐药性之间的相关性及其功能作用和机制的研究仍然很少。
本研究旨在探讨circRNAs对非小细胞肺癌奥西替尼耐药性的影响及其潜在机制，对理解非小细胞肺癌奥西替尼耐药性的分子机制和制定延缓或克服耐药性的策略具有重要的临床意义。
结果：
circRNA 表达谱
提取肿瘤组织总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示所有样本的A260/280值均在1.90~2.08之间，A260/230值在2.01~2.15之间。对提取的RNA进行标记，染料浓度均在10.00 pmol/µL以上，比活度值均在11 pmol/µL以上，总质量均在15.00 µg以上。结果表明提取的总RNA纯度高，未降解，RNA标记效率高，符合circRNAs芯片检测的条件。采用circRNAs芯片分析对circRNAs表达谱进行评估。使用倍数变化 (FC) 阈值和火山图分析过滤来评估样本间 circRNAs 的差异表达。
circ_PPAPDC1A 在奥希替尼耐药 NSCLC 组织中显著上调
circRNAs芯片筛选结果显示在奥希替尼耐药与敏感组织中差异表达的circRNA共468个，满足倍数变化（FC）≥2且显著性水平P <0.05的标准。其中，242个circRNA在耐药组织中表现出上调的表达模式，而226个circRNA表现出下调。在众多的差异表达circRNA中，我们选取了上调和下调最多的前10个circRNA进行聚类可视化分析。聚类热图（图 1 A）揭示了上调和下调最多的前10个circRNA，详细注释见表 1 和 表2。circ_100696是奥希替尼耐药NSCLC组织中上调最多（8.08倍）的circRNA，原始强度最高（图 1 A）。经过文献分析，随机选取10个circRNA进行RT-qPCR验证，上调和下调表达模式各占1/3，选择标准包括两个样品芯片中表达差异6倍以上和原始强度均超过100。结果表明，RT-qPCR与circRNAs芯片结果一致，验证了circRNAs芯片结果的可靠性(图1 B ) 。本研究进一步对差异表达的circRNAs编码基因进行了生物信息学分析，包括GO功能注释分析和KEGG信号通路分析。GO和KEGG分析显示，差异表达的circRNAs基因符号与一系列生物学过程有关(图 1 C )。此外，它们在与肿瘤发生相关的信号通路中表现出富集，特别是TGF-β通路(图 1 D )。
【图1】 circRNAs参与了奥希替尼的耐药性。A .Top 10 circRNAs聚类热图；B . RT-qPCR验证( n =3):RT-qPCR结果与circRNA芯片结果一致；C . Gene Ontology注释分析。BP:生物过程，CC:细胞成分，MF:分子功能。D . KEGG信号通路富集分析。OS:奥希替尼敏感;OR:奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录-定量PCR。circ_100696: circ_PPAPDC1A
表1 .前20个显著上调的circRNA详细注释
表2 .前20个显著下调的circRNA详细注释
circ_PPAPDC1A 在奥希替尼耐药 NSCLC 细胞中显著上调
通过查询 circBase 数据库 ( http://circrna.org/ )，发现 circRNA_100696 位于 10 号染色体 q26.12:122273422–122,280,607 位置。它是最常见的外显子来源的 circRNA，与基因符号 PPAPDC1A (NM_001030059) 相连，因此 circ_100696 也称为 circ_PPAPDC1A。该 circRNA 由 PPAPDC1A 基因的第 3、4 和 5 个外显子剪接而成。基因组长度为 7185 bp，而剪接序列长度为 280 bp。本研究选取对奥希替尼敏感的PC9和HCC827细胞株作为亲本细胞，通过延长药物暴露时间（AZD9291浓度从10nM逐渐增至500nM）和延长筛选时间（停药后仍保持耐药性）建立对奥希替尼高度耐药的细胞株，并分别命名为PC9/OR和HCC827/OR。CCK-8验证实验显示，AZD9291在非小细胞肺癌PC9和HCC827细胞中表现出明显的剂量依赖性增殖抑制作用，IC50值分别为0.17µM和0.15µM。然而，在0.75-1µM浓度下，AZD9291在PC9/OR和HCC827/OR细胞中仅达到约25%的增殖抑制，表明这些细胞株具有较高的耐药性（图 2 A）。我们进行了荧光原位杂交（FISH）实验以确定circRNA_100696表达的亚细胞定位。结果显示，circRNA_100696广泛存在于PC9/OR和HCC827/OR细胞中，主要定位在细胞质中富集。此外，RT-qPCR检测表明，与PC9和HCC827细胞相比，circ_PPAPDC1A在人正常肺上皮细胞EAS-2B中的表达明显降低（P < 0.05）。同时，RT-qPCR检测显示，与亲本PC9和HCC827细胞相比，PC9/OR和HCC827/OR细胞中的circRNA_100696表达明显较高（P < 0.05；图 2 B）。此外，我们观察到circRNA_100696在PC9/OR细胞中的表达量略低于HCC827/OR细胞，但这种差异并不具有统计学意义（P >0.05；图 2 B）。进一步，我们构建了circRNA_100696过表达和敲低的慢病毒载体，并稳定转染到PC9/OR和HCC827/OR细胞及其亲本细胞中，成功构建了circRNA_100696过表达和敲低的细胞模型（P <0.05；图 2 C，D）。
【图2】 circ_PPAPDC1A表达在奥希替尼耐药NSCLC组织和细胞中升高。A. 成功建立奥希替尼耐药细胞，分别命名为PC9/OR和HCC827/OR。通过RT-qPCR评估转染效率。B .RT -qPCR分析PC9/OR和HCC827/OR细胞中circ_100696的表达。circRNA_100696表达水平以GAPDH标准化。C 、 D .成功建立circRNA_100696过表达和敲低细胞模型。随后将circ_100696过表达和敲低慢病毒载体稳定转染到PC9/OR和HCC827/ OR 细胞以及它们的亲本PC9和HCC827细胞中。n = 3。* P < 0.05，** P < 0.01，na：无统计学意义。OS,奥希替尼敏感；OR：奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录定量 PCR。circ_100696: circ_PPAPDC1A
circ_PPAPDC1A 降低 NSCLC 对奥希替尼的敏感性并抑制细胞体外恶性行为
为了探索circ_PPAPDC1A对NSCLC细胞增殖和奥希替尼敏感性的影响，我们在体外将PC9、HCC829、PC9/OR和HCC829/OR细胞暴露于不同浓度的AZD9291（0 µM、0.25 µM、0.5 µM、0.75 µM、1.0 µM）。CCK-8测定显示circ_PPAPDC1A对PC9和HCC827细胞的细胞增殖没有显著影响（P < 0.05）。但是，CCK-8测定显示circ_PPAPDC1A过表达显著降低PC9和PC9/OR细胞对AZD9291的敏感性；相反，circ_PPAPDC1A 干扰显著增强了 HCC827/OR 细胞对 AZD9291 的敏感性，部分逆转了耐药性（P < 0.05；图 3 A）。然而，干扰 HCC827 细胞中 circ_PPAPDC1A 的表达对 AZD9291 的敏感性没有显著影响。因此，我们将研究重点放在 PC9/OR 和 HCC829/OR 细胞上。这些细胞系在体外用 0.5µM AZD9291 处理 14 天。后续实验包括软琼脂菌落实验（P < 0.05；图 3 B）、EdU 实验（P < 0.05；图 3 C）、Transwell 小室实验（P < 0.05；图 3 D）、细胞划痕实验（P < 0.05；图 3 E）和 Annexin V-FITC/PI 实验（P < 0.05；图 3 F）表明，过表达 circ_PPAPDC1A 可增强 PC9/OR 细胞的克隆形成能力和 DNA 复制，促进细胞侵袭和迁移，同时抑制细胞凋亡。相反，干扰 circ_PPAPDC1A 可导致 HCC827/OR 细胞的克隆形成能力降低和 DNA 复制受阻，有效降低细胞侵袭和迁移，同时促进细胞凋亡。
【图3】 circ_PPAPDC1A 降低了 NSCLC 对 Osimertinib 的敏感性，并抑制了细胞体外恶性行为。A.细胞计数试剂盒-8 (CCK8) 测定以确定 Osimertinib 的 IC50 值。B.采用软琼脂菌落测定来评估菌落形成能力。C.进行 EdU 测定以评估 DNA 合成能力。D .进行 Transwell 小室测定以分析细胞侵袭能力。E.进行细胞划痕试验以检查细胞迁移能力。F. Annexin V-FITC/PI 测定以研究细胞凋亡。n = 3。* P < 0.05，** P < 0.01。OS，奥希替尼敏感；OR：奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录-定量 PCR。circ_100696：circ_PPAPDC1A
circ_PPAPDC1A 可作为 miR-30a-3p 的有效 miRNA 海绵
circRNA 被认为是 miRNA 海绵，可以调节特定靶基因的表达。在我们的研究中，我们确定 hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-30d-3p、hsa-miR-2113、hsa-miR-30e-3p 和 hsa-miR-10b-3p 是 circ_PPAPDC1A 最靶向的 5 个 miRNA（图 4 A）。利用 Arraystar 的独家软件，我们确定这些 miRNA 与 circ_PPAPDC1A 表现出特异性结合亲和力（P < 0.05；图 4 B）。随后的RT-qPCR分析表明，与相应的奥希替尼敏感组织相比，hsa-miR-30a-3p，hsa-miR-30d-3p和hsa-miR-10b-3p在奥希替尼耐药组织中下调，而hsa-miR-2113和hsa-miR-30e-3p无明显表达差异。值得注意的是，在这些miRNA中，hsa-miR-30a-3p表现出最明显的下调（P <0.05；图 4 D）。Pearson相关性分析显示，在奥希替尼耐药组织中，circ_PPAPDC1A和miR-30a-3p表达之间呈负相关趋势，但由于样本量小，无统计学意义（n = 5；r =-0.81，P = 0.11）。因此，选择 miR-30a-3p 作为进一步研究的潜在目标 miRNA。为了验证相互作用，进行了双荧光素酶报告基因检测（表3）。在共转染 pmirGLO-circ_100696-wt 和 miR-30a-3p mimic 的 HEK-293T 细胞中，与共转染 pmirGLO-circ_100696-wt 和 miR-30a-3p NC 的细胞相比，荧光素酶活性明显降低（P < 0.05；图 4 E）。然而，在共转染 pmirGLO-circ_100696-mut 和 miR-30a-3p mimic 或 pmirGLO-circ_100696-mut 和 miR-30a-3p NC 的细胞中未观察到荧光素酶活性的显著改变（P > 0.05；图 4 E）。为了进一步验证 circ_PPAPDC1A 对 miR-30a-3p 的功能靶向性，我们采用了 RT-qPCR。该分析表明，与 OV-NC 和 sh-NC 组相比，circ_100696 OV 组的 miR-30a-3p 表达显著降低，sh-circ_100696 组的 miR-30a-3p 表达增加（P < 0.05；图 4 F）。荧光原位杂交 (FISH) 分析进一步证实了 circ_PPAPDC1A 和 miR-30a-3p 分别定位在细胞质和细胞核中（图 4 D）。这些结果共同表明 miR-30a-3p 特异性结合 circ_PPAPDC1A，并且 circ_PPAPDC1A 负向调节奥希替尼耐药细胞中的 miR-30a-3p 表达，表明 miR-30a-3p 是 circ_PPAPDC1A 的功能性靶 miRNA 之一，发挥 miRNA 海绵效应。
【图4】circ_PPAPDC1A 在奥希替尼耐药 NSCLC 细胞中作为 miR-30a-3p 的有效 miRNA 海绵。A .circ_PPAPDC1A 靶向的前五个 miRNA。B.预测了 circ_100696-miRNA 相互作用，并显示了 circ_100696 和前五个靶向 miRNA 之间的假定结合位点。C .RT-qPCR 分析表明，hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-30d-3p 和 hsa-miR-10b-3p 在奥希替尼耐药组织中下调，而 hsa-miR-30a-3p 表现出最明显的下调。D.荧光原位杂交 (FISH) 发现 circ_100696 和 miR-30a-3p 分别位于细胞质和细胞核中。E .双荧光素酶报告基因检测证实 miR-30a-3p 可以竞争性靶向 circ_100696 (HEK-293T)。F .RT-qPCR 检测表明，与对照组相比，circ_100696 OE 组的 miR-30a-3p 表达显着降低，sh-circ_100696 组的 miR-30a-3p 表达显着升高。n = 3。* P < 0.05，** P < 0.01，na：无统计学意义。OS ,奥希替尼敏感；OR,,奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录-定量PCR。circ_100696：circ_PPAPDC1A。OE：过表达
表3 circRNA-野生型/突变型质粒构建
miR-30a-3p 在奥希替尼耐药中起肿瘤抑制作用
为了探究miR-30a-3p对NSCLC细胞奥希替尼敏感性的影响，我们构建了miR-30a-3p模拟物和抑制剂，随后通过Lipofectamine TM3000稳定转染到PC9/OR和HCC827/OR细胞中（P <0.05；图 5 A）。转染后，我们将PC9/OR和HCC827/OR细胞暴露于不同浓度的AZD9291（0 μM，0.25 μM，0.5 μM，0.75 μM，1.0 μM）。CCK-8分析显示，miR-30a-3p模拟物显著增强PC9/OR细胞对AZD9291的反应性，部分逆转了耐药性。相反，miR-30a-3p 抑制剂显著降低了 HCC827/OR 细胞对 AZD9291 的敏感性（P < 0.05；图 5 B）。此外，我们在体外用 0.5 µM AZD9291 处理 PC9/OR 和 HCC827/OR 细胞 14 天。随后的分析包括软琼脂菌落测定（P < 0.05；图 5 C）、Transwell 室测定（P < 0.05；图 5 D）和 Annexin V-FITC/PI 测定（P < 0.05；图 5 E）表明，miR-30a-3p 表达的上调抑制了 PC9/OR 细胞的克隆形成和侵袭能力。相反，miR-30a-3p 表达的下调会增强 HCC827/OR 细胞的克隆形成和侵袭趋势。此外，增加 miR-30a-3p 表达会促进 PC9/OR 细胞凋亡，而抑制 miR-30a-3p 表达会阻碍 HCC827/OR 细胞凋亡。
【图5】 miR-30a-3p 在奥希替尼耐药的 NSCLC 中起肿瘤抑制作用。A.成功建立 miR-30a-3p 过表达和敲低细胞模型：miR-30a-3p 模拟物和抑制剂，随后分别稳定转染到 PC9/OR 和 HCC827/OR 细胞中。通过 RT-qPCR 评估转染效率。B .进行细胞计数试剂盒-8 (CCK8) 测定以确定奥希替尼的 IC50 值。C.采用软琼脂菌落试验评估菌落形成能力。D.进行 Transwell 小室试验分析细胞侵袭能力。F. Annexin V-FITC/PI 测定以研究细胞凋亡。* P < 0.05，** P < 0.01。OS，奥希替尼敏感；OR，奥希替尼耐药。circ_100696：circ_PPAPDC1A
IGF1R被确定为miR-30a-3p的功能靶基因
通过三个 miRNA 靶基因数据库（miRWalk、TargetScan 和 miRanda）预测了 miR-30a-3p 的潜在靶点，共列出了 315 个基因。在这些基因中，众所周知的肿瘤抑制因子 IGF1R 表现出较高的预测评分（如图 6 A 所示）。使用 RT-qPCR 和 western blot 进一步研究显示，与奥希替尼敏感组织相比，奥希替尼耐药组织中 IGF1R mRNA 和蛋白质显著上调（P < 0.05；图 6B、C）。Pearson 相关性分析显示，在奥希替尼耐药组织中，IGF1R mRNA 和 miR-30a-3p 表达呈负相关趋势，但由于样本量小，无统计学意义（n = 5；r =-0.74，P = 0.15）。根据 microRNA 反应元件 (MRE) 分析，发现 miR-30a-3p 在 IGF1R 的 3'-UTR 区域内具有潜在结合位点。因此，我们将野生型 (wt) 和突变型 IGF1R-3'-UTR 序列（每个序列都包含预测的结合位点）插入荧光素酶报告质粒中。随后的荧光素酶测定显示，与 miR-30a-3p 阴性对照 (NC) 或 IGF1R-3'-UTR-mut 组相比，IGF1R-3'-UTR-wt 和 miR-30a-3p 模拟物共转染组的相对荧光素酶活性显着降低（均为P < 0.05；图 6 D）。此外，我们研究了 miR-30a-3p 对 IGF1R 的下游影响。我们的 RT-qPCR 和蛋白质印迹分析表明，与 miR-30a-3p NC 组相比，miR-30a-3p 模拟物组的 IGF1R mRNA 和蛋白质水平显著降低，而 miR-30a-3p 抑制剂组的 IGF1R mRNA 和蛋白质水平显著升高（均为P < 0.05；图 6 E、F）。这些发现表明 IGF1R 是 miR-30a-3p 的功能性靶基因。
【图6】IGF1R 被确定为奥希替尼耐药 NSCLC 细胞中 miR-30a-3p 的功能性靶基因。A.示意图显示 miR-370-3p 特异性结合 IGF1R。RT-qPCR（B）和 Western-blot（C）检测证实，在奥希替尼耐药 NSCLC 组织中 IGF1R mRNA 和蛋白表达显著上调。D.双荧光素酶报告基因检测证实 miR-30a-3p 可以竞争性靶向 IGF1R 的 wt 3'UTR 序列（HEK-293T）。RT-qPCR（E）和 Western-blot（F ）检测表明，与对照组相比，miR-30a-3p 模拟物中 IGF1R mRNA 和蛋白表达显著降低，miR-30a-3p 抑制剂组 IGF1R mRNA 和蛋白表达升高。n = 3。* P < 0.05，** P < 0.01，na：无统计学意义。OS,奥希替尼敏感；OR,奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录-定量 PCR。circ_100696：circ_PPAPDC1A。UTR，非翻译区。Wt，野生型
研究报告称，LINC01436 通过充当 microRNA (miR)-30a-3p 海绵来调节其靶基因 EPAS1 的表达，从而促进 NSCLC 进展。EPAS1 可能与奥希替尼耐药有关。因此，我们的研究还探讨了 EPAS1 在奥希替尼耐药中的作用。然而，我们的补充研究发现，NSCLC 奥希替尼敏感和耐药细胞之间的 EPAS1 mRNA 和蛋白质表达没有显著差异（均为P > 0.05）。此外，我们敲除了 EPAS1 以探索其对 NSCLC 细胞中奥希替尼敏感性的影响。随后，将PC9、HCC829、PC9/OR和HCC829/OR细胞体外暴露于不同浓度的AZD9291（0μM、0.25μM、0.5μM、0.75μM、1.0μM）。CCK-8测定结果显示，敲除EPAS1不会影响PC9、HCC829、PC9/OR和HCC829/OR细胞对奥希替尼的敏感性（均为P >0.05）。因此，我们的补充实验表明，虽然EPAS1可能在NSCLC的恶性进展中发挥作用，但其在奥希替尼耐药性发展中的作用可能很小。
circ_PPAPDC1A 通过调节 miR-30a-3p 表达和激活 IGF1R/PI3K/AKT/mTOR 通路促进奥希替尼耐药性
我们进行了多项挽救实验来验证 circ_PPAPDC1A/miR-30a-3p/IGF1R 轴在调节 NSCLC 对奥希替尼耐药中的作用。CCK-8、软琼脂集落、Matrigel 侵袭和 Annexin V-FITC/PI 测定的结果表明，过表达 circ_PPAPDC1A 促进细胞增殖和侵袭，同时抑制细胞凋亡。相反，沉默 circ_PPAPDC1A 会抑制细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡。值得注意的是，在用 miR-30a-3p 模拟物和模拟物抑制剂治疗后，这些影响被逆转（P < 0.05；图 7 A-C）。我们还通过 RT-qPCR 和 Western blot 测定评估了 IGF1R 的表达水平。结果显示，在circ_PPAPDC1A过表达组，IGF1R mRNA和蛋白表达显著增加，而在sh-circ_PPAPDC1A组中降低，但这些影响分别被miR-30a-3p模拟物和抑制剂减弱（P < 0.05；图 8 A，B）。此外，我们的研究强调了IGF1R基因下游的PI3K/AKT/ mTOR信号通路。Western blot检测结果显示，在circ_PPAPDC1A过表达组，p-PI3K，p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平显著降低，而在sh-circ_PPAPDC1A组，p-PI3K，AKT和p-mTOR蛋白表达水平显著升高，但这些变化并不影响PI3K，AKT和mTOR蛋白的表达。这些发现表明，circ_PPAPDC1A可以通过IGF1R激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，而抑制则产生相反的效果。重要的是，在用 miR-30a-3p 模拟物和模拟物抑制剂治疗后，这些影响再次被逆转（P <0.05；图 8C ）。总之，circ_PPAPDC1A 通过调节 miR-30a- 3p表达和激活 IGF1R/PI3K/AKT/mTOR 通路促进奥希替尼耐药性。
【图7】 circ_PPAPDC1A 通过调节 miR-30a-3p 的表达促进 NSCLC 中的奥希替尼耐药性。PC9/OR 细胞与 circ_100696 OE 载体和 miR-30a-3p 模拟物共转染。HCC827/OR 细胞也与 sh-circ_100696 和 miR-30a-3p 抑制剂共转染。A.细胞计数试剂盒-8 (CCK8) 测定 ;( B ) 软琼脂菌落测定、( C ) Matrigel 侵袭和（D）Annexin V-FITC/PI 测定显示 circ_PPAPDC1A/miR-30a-3p 轴对细胞增殖、克隆形成侵袭和凋亡的影响。circ_PPAPDC1A 促进细胞增殖和侵袭，同时抑制细胞凋亡。但用 miR-30a-3p 模拟物和模拟物抑制剂处理后，这些作用发生逆转。n = 3。* P < 0.05，** P < 0.01，na：无统计学意义。OS，奥希替尼敏感；OR：奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录-定量 PCR。circ_100696：circ_PPAPDC1A。OE：过度表达
【图8】 IGF1R/PI3K/AKT/mTOR 通路可由 circ_PPAPDC1A /miR-30a-3p 轴激活。PC9/OR 细胞与 circ_100696 OE 载体和 miR-30a-3p 模拟物共转染。HCC827/OR 细胞也与 sh-circ_100696 和 miR-30a-3p 抑制剂共转染。RT-qPCR 和 Western-blot 分析 circ_100696 和 miR-30a-3p 转染组中 IGF1R mRNA 和蛋白质表达 ( A - B ) 和 ( B ) PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 蛋白表达。circ_PPAPDC1A 可通过调节 miR-30a-3p 的表达激活 IGF1R/PI3K/AKT/mTOR 通路，但这些作用可被 miR-30a-3p 逆转。n = 3。* P < 0.05，** P < 0.01，na：无统计学意义。OS，奥希替尼敏感；OR：奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录-定量 PCR。circ_100696：circ_PPAPDC1A。OE：过度表达
circ_PPAPDC1A 抑制体内 NSCLC 对奥希替尼的敏感性
建立图9 A所示的小鼠异种移植瘤模型， 研究circ_PPAPDC1A在体内对奥希替尼的增敏作用。随后，将1 × 10 6 个奥希替尼耐药的PC9/OR和HCC827/OR细胞（分别用慢病毒载体转染）注射到裸鼠腋下。与对照组的比较分析显示，circ_PPAPDC1A过表达组的肿瘤生长速度、肿瘤重量和肿瘤体积显著增加，而sh-circ_PPAPDC1A组的这些参数显著降低（P < 0.05；图 9 B，C）。采用Ki-67染色评估PC9/OR和HCC827/OR细胞在体内的增殖指数。结果显示，circ_PPAPDC1A过表达组Ki-67阳性细胞比例显著增加，sh-circ_PPAPDC1A组Ki-67阳性细胞比例显著减少（P < 0.05；图 9 D）。此外，对异种移植瘤样本进行的TUNEL凋亡实验表明，circ_PPAPDC1A过表达抑制了体内PC9/OR细胞的凋亡，而circ_PPAPDC1A沉默促进了体内HCC827/OR细胞的凋亡（P < 0.05；图 9 F）。这些结果与体外结果一致，表明circ_PPAPDC1A在体内抑制NSCLC对奥希替尼的敏感性中发挥作用。
【图9】 circ_PPAPDC1A抑制NSCLC对奥希替尼的体内敏感性。A.通过PC9/OR和HCC827/OR细胞皮下注射结合AZD9291治疗建立裸鼠皮下肿瘤模型，喂养5周后处死小鼠，取出裸鼠测量大小并称重。(B)异种移植瘤生长曲线和(C) 异种移植瘤重量显示circ_PPAPDC1A抑制NSCLC对奥希替尼的体内敏感性。D.测量异种移植瘤中Ki67 阳性细胞的百分比。E.进行TUNEL分析以检测异种移植瘤中的细胞凋亡率。n = 3。* P < 0.05，** P < 0.01，na：无统计学意义。OS,奥希替尼敏感；OR,奥希替尼耐药。RT-qPCR，逆转录-定量 PCR。circ_100696：circ_PPAPDC1A。OE：过度表达
小结：
总之，本研究首次强调并确定了 circ_PPAPDC1A 显著上调，并通过在 NSCLC 中将 miR-30a-3p 吸收到活跃的 IGF1R/PI3K/AKT/mTOR 通路中，在 NSCLC 的奥希替尼耐药中发挥致癌作用。circ_PPAPDC1A 可作为对奥希替尼耐药的 NSCLC 患者的新型诊断生物标志物和治疗靶点。
评价：
研究 circRNA 及其在 NSCLC 奥希替尼耐药中的作用是一个有前途的研究方向。随着本研究对 circRNA 复杂调控功能的理解不断加深，它有可能揭示出增强靶向治疗疗效和克服 NSCLC 患者耐药性的新策略。进一步的研究和临床验证对于充分利用 circRNA 在这一背景下的临床意义至关重要。
（翻译及校验：张滢）
图1: 聚集的循环肿瘤细胞。肿瘤细胞紧密聚集，形成大团块。(血红素-伊红染色)
图2: 患者抽取流程图。排除 37 例无 NSCLC 的患者（转移，33 例；非特异性反应性炎症，4 例），A 组选取 68 例，B 组选取 11 例，C 组选取 31 例，D 组选取 18 例。
图3: 根据围手术期集群循环肿瘤细胞状态的生存曲线。在无复发生存期（RFS）分析中，集群循环肿瘤细胞（CTC）阳性组的2年RFS率为50.3%，集群循环肿瘤细胞阴性组为94.3%（P<0.01）。在总生存期（OS）分析中，CTC阳性聚集组的2年OS率为82.0%，CTC阴性聚集组为92.0%（P=0.06）。
图4: 根据围手术期CTC集群和辅助化疗情况绘制的生存曲线。在无复发生存率（RFS）分析中，A组的2年RFS率为94.9%，B组为91.0%，C组为36.3%，D组为71.8%，A组和B组的总RFS无显著差异（P = 0.8），但C组和D组有显著差异（P < 0.01）。在总生存率（OS）分析中，A 组的 2 年 OS 率为 90.6%，B 组为 100.0%，C 组为 72.0%，D 组为 94.4%，A 组与 B 组之间（P = 0.3）或 C 组与 D 组之间（P = 0.1）无统计学差异。A 组，围手术期集群 CTC 阴性和 ACT 阴性；B 组，围手术期集群 CTC 阴性和 ACT 阳性；C 组，围手术期集群CTC 阳性和 ACT 阴性；D 组，围手术期集群CTC 阳性和 ACT 阳性。
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