免疫代谢——以及其验证实验方法

衣康酸

生物合成、代谢转化和 "自我调节

    衣康酸是由顺式-碳酸根脱羧酶（ACOD1，又称 IRG1 和 CAD）催化的顺式-碳酸根脱羧反应生成的，ACOD1 是由免疫反应基因 1（irg1）编码的线粒体基质酶。顺式碳酸乌头酸盐是 TCA 循环中的过渡性中间产物，因此通常不属于后者的 8 个不同步骤。顺式-乌头酸可在丙酮酸催化异构化的限速步骤15中释放出来，该步骤包括两步脱水-再脱水顺序，通过顺式-乌头酸将柠檬酸转化为异柠檬酸。柠檬酸来自 TCA 循环的第一步：柠檬酸合成酶（CS）催化的乙酰-CoA 和草酰乙酸的缩合。

    由此产生的衣康酸可完成以下代谢循环：转化为衣康酰辅酶 A（CoA）；随后转化为柠檬酰-CoA，后者经柠檬酰-CoA 裂解酶（CLYBL）分解，产生丙酮酸和乙酰-CoA；乙酰-CoA 可重新进入 TCA 循环。最近的报告进一步表明，衣康酸在细胞内有可能异构化为结构异构体、中康酸和柠檬酸。[中康酸和柠康酸 "讨论了这些异构体]。有趣的是，在线粒体基质中产生的衣康酸的作用超出了其产生部位。线粒体内膜上的 SLC25A11--二羧酸盐、柠檬酸盐和α-氧代戊二酸盐溶质载体蛋白--参与了衣康酸从线粒体输出的过程。向细胞外空间的输出被认为是由 ATP 结合盒（ABC）转运体 G2（ABCG2）介导的，ABCG2 是 ABC 转运体超家族的成员，可输出多种外（内）源物质，如细胞毒性药物、毒素和激素。ABCG2 是化疗中对抗多药耐药性的一个很有前景的靶点。然而，转运体在 mt-REMs 胞室间和细胞间信号转导作用中的遗传必要性和充分性仍有待验证。

    IRG1 在先天性免疫细胞的髓系细胞中，尤其是巨噬细胞中，会在促炎条件下被诱导表达，而在树突状细胞和中性粒细胞中的表达则会减少。从贻贝等海洋无脊椎动物到哺乳动物的巨噬细胞，IRG1在不同类群中高度保守，是宿主先天免疫反应的重要基因。在活化的巨噬细胞中，IRG1 的表达明显（高达约 200 倍）上调。Toll 样受体（TLR）信号在多种类型的免疫细胞中起作用，细胞因子（参与免疫信号转导的蛋白质因子）驱动的信号作用也是驱动 IRG1 上调的途径之一。此外，细菌抗原脂多糖（LPS）可刺激巨噬细胞表面的 TLR4，从而启动信号级联，激活各种转录因子并上调免疫反应基因，包括IRG1。此外，氧化应激相关的 ROS 上调也支持 IRG1 的诱导。RAW264.7 小鼠巨噬细胞样细胞在 LPS 诱导的免疫活化后，细胞内衣康酸的浓度从基础、非活化巨噬细胞的亚微摩浓度上升到 ~8 mM。据报道，在小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）中，经 LPS刺激后，衣康酸水平可达 ~5 mM。这种毫摩尔浓度也是衣康酸发挥抗菌功效的剂量范围，但其潜在的分子机制尚未探明。有趣的是，与免疫反应和炎症信号通路相关的多种潜在转录因子（TFs）被认为在炎症过程中调节。最近的一项计算预测显示，IRF1 是小鼠和人类通路网络中得分最高的 TF。虽然 siRNA 敲除 IRF1 会降低 IRG1 在人源 PBMCs 巨噬细胞和小鼠 RAW264.7细胞中的表达，但经验验证仍然有限。其他推测的 IRG1 调节 TF 包括NF-κB、STAT1、STAT3、IRF3 和CEBPβ。

    有趣的是，越来越多的（前期）临床研究表明，IRG1 在多种癌症中具有类似癌基因的行为。IRG1基因敲除（KO）可积极改善基于ICB的抗癌免疫疗法的临床疗效。例如，IRG1-KO 可逆转肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞和髓源性免疫抑制细胞的不良免疫抑制。此外，当 IRG1-KO 嵌合抗原受体（CAR）-巨噬细胞与 ICB 疗法（如抗 CD47 或抗 PD1 抗体）同时使用时，对肿瘤的治疗效果也会增强。鉴于 IRG1 活性的临床意义凸显了衣康酸在调节免疫行为中的重要性，人们可能会认为模仿衣康酸的小分子调节剂是开发抗癌药物的一条大有可为的途径。但是，这种努力目前面临着巨大的挑战。其中一个主要困难是，衣康酸调控蛋白/通路的数量不断增加，但对其特定环境的了解却很少。

    至关重要的是，衣康酸能够与多种靶点相互作用，这使得细胞能够 “自我调节 ”衣康酸的水平，而不必绝对依赖于 IRG1 的表达/活性水平。即使在线粒体内，衣康酸也可作为琥珀酸脱氢酶（SDH）的可逆竞争性底物模拟抑制剂，在 TCA 循环中顺式-乌头酸生成的下游发挥作用。这种反馈抑制事件减少了线粒体内可用的局部衣康酸库，并减缓了 TCA 循环的通量。后一方面可能会进一步减少依赖于 IRG1 的衣康酸生物合成，原因是 TCA 循环通量降低导致顺式-乌头酸生成减少。在某些情况下，如缺氧时，TCA 反向通量通过 α-氧戊二酸还原羧化为异柠檬酸[在异柠檬酸脱氢酶（IDH2）的线粒体驻留异构体而发生，IRG1 贫乏的巨噬细胞表现出 IDH2 活性增强。由于异柠檬酸酯通过顺式丙酸酯与柠檬酸酯的可逆异构化可以双向进行，这种反向 TCA 通量为 IRG1 催化衣康酸的产生提供了另一种特定的途径。另一方面，衣康酸也能抑制纯化的 IDH2-酶（及其细胞膜变体 IDH1），尽管其他研究结果暗示缺乏直接抑制作用。环境、时间和地点可能是解构刺激行为与抑制行为的关键。

免疫调节活性

    衣康酸具有在活化巨噬细胞的代谢过程和免疫反应之间架起桥梁的独特潜力，因此其表型影响至关重要。活化的巨噬细胞通常被简化为 M1（经典活化）和 M2（替代活化）亚型。M1 型巨噬细胞通常由 LPS 和 IFN-γ 诱导，与促炎反应有关，是宿主抵御病原体的关键。由 IL-4 和 IL-13 等诱导的 M2-巨噬细胞可进行抗炎活动：如组织修复和炎症消退。在肿瘤微环境中，M2-巨噬细胞的免疫抑制行为阻碍了细胞毒性 T 细胞的启动，因此通常会促进肿瘤的发展。然而，M1/M2 的分类过于简单，因为巨噬细胞可根据环境线索/背景显示出具有促炎和抗炎特征的混合或过渡表型。不过，衣康酸的产生主要与经典的活化 M1-巨噬细胞有关，它将线粒体代谢与促炎免疫反应联系在一起。然而，如此产生的衣康酸可同时刺激促炎和抗炎行为，其具体方式尚不清楚。至关重要的是，衣康酸能激活特定途径，如 Nrf2 转录因子介导的抗氧化信号轴，进而刺激 M2 样表型，这构成了衣康酸促进 M2 样抗炎行为的一种可能机制，尽管其产生只与 M1 样促炎巨噬细胞有关。相反，在替代活化的M2-巨噬细胞中，IRG1 的表达和衣康酸的产生并不明显。

    衣康酸在调节巨噬细胞分泌的细胞因子和趋化因子（即参与细胞迁移的趋化细胞因子）的产生和分泌方面也起着至关重要的作用。这是否涉及衣康酸与细胞因子/趋化因子之间的直接相互作用，目前仍未解决。细胞因子和趋化因子既可在局部发挥作用，也可通过旁分泌和内分泌信号在全身发挥作用。在 M1 巨噬细胞中，衣康酸可下调 IL-6 和 IL-12 促炎细胞因子的分泌，同时上调 CXCL10-趋化因子的分泌，后者可驱动多种先天性和适应性免疫细胞类型的迁移。因此，衣康酸对近端和远端免疫反应都有影响。然而，衣康酸的生物活性对细胞类型的特异性影响，以及支持其背景生物活性并帮助形成观察到的表型的潜在介质，在很大程度上仍然难以解决。此外，鉴于衣康酸可能与其异构体发生相互转化（“中康酸和柠康酸”），传统的遗传学/生物化学工具无法全面描述衣康酸的机理影响。因此，有必要采用新技术，特别是能够利用 mt-REMs 进行时空控制扰动的技术。

    STING是一种与ER-线粒体-膜相关的跨膜蛋白，它的激活是对各种类型的细胞膜DNA（包括致病DNA和来自宿主的受损核/线粒体DNA）的一种重要的先天免疫反应。STING 与 cGAMP 结合，随后招募 TBK1（TBK1 可使 STING 磷酸化），这与启动细胞坏死性凋亡途径（如铁死亡、焦亡和坏死性凋亡）密切相关。代谢组学研究显示，当 DMXAA（一种小鼠 STING 激动剂）处理 RAW264.7 细胞和小鼠原代BMDMs 时，衣康酸水平激增。测得的衣康酸升高、IRG1 上调以及 STING 磷酸化的相关降低，构成了表明衣康酸在 STING 信号转导中起抑制作用的初步证据。

    进一步的研究发现，衣康酸的假定模拟物 4-OI 能显著抑制 STING 磷酸化和通路激活。在过表达 STING 的 HEK293T 细胞中，4-OI 处理会导致 STING 在多个半胱氨酸位点（148；在人和小鼠 STING 同源物中分别为 65、71、88 和 147）发生烷基化。值得注意的是，C148（小鼠为 147）是 cGAMP 结合诱导 STING 磷酸化的关键功能位点，是 STING 功能的必经之路。因此，C148（147）特异性 STING 烷基化被认为会抑制 STING 的功能。重要的是，C148(147)是 STING 基础功能的一个必要位点，这使得无法利用诱变将位点特异性标记与 4-OI 通过 STING 诱导的 nE-PTM 信号联系起来。据报道，抑制 STING 可抑制炎症因子（如 I 型干扰素）和促炎细胞因子（如 TNF-α 和 IL-6）的产生。这种作用与小鼠脓毒症模型尤其相关，在该模型中，腹腔注射衣康酸或 4-OI 能显著抑制 STING 磷酸化。

    一个独立的发现指出，NRF2 是STING的一个重要反调节因子。NRF2/AR 的上调抑制了 KEAP1-KD A549 细胞中 STING 的表达，并增加了对 DNA 病毒感染的敏感性。针对对照组对 NRF2-KD 细胞进行的 RNA-Seq 和 qPCR 分析表明，NRF2 激活会下调编码 STING 的基因tmem173-mRNA。在舒拉叶烷（一种基于 RES 的 KEAP1/NRF2/AR 天然诱导剂）处理的细胞和 KEAP1-KD 细胞中检测到的较低tmem173-mRNA 水平支持了这一结果。此外，ChIP-seq 和使用 NRF2 抑制剂 ML385（可破坏 NRF2 与 DNA 的结合）的实验结果表明，活化的 NRF2 下调tmem173 转录本的机制不是通过基因组相互作用，而可能是通过转录后调控。在放线菌素-D 诱导的 mRNA 合成抑制后，NRF2-KD A549 细胞（与 WT 组相比）中tmem173mRNA 的衰减较慢，这也证明了这一点，意味着 NRF2 降低了刺-mRNA 的稳定性。该研究强调了衣康酸介导的 KEAP1/NRF2/AR 与 STING 信号之间的潜在串扰。

    ATF3 是一种抗炎转录因子，也是 IκB 蛋白家族中关键的促炎成员 IκBζ 的负调控因子。ATF3-IκBζ 轴调节细胞因子的产生，并与线粒体应激反应有关。ATF3-IκBζ 通路失调会导致免疫反应失衡，如在自身免疫性疾病、癌症和感染中，要么促进过度炎症，要么无法充分管理致病威胁。利用衣康酸二甲酯（DI，衣康酸的另一种假定模拟物，具有增加细胞渗透性和强烈升高反应性的作用；随后的研究表明其代谢失调行为）推断衣康酸具有调节 ATF3-IκBζ 轴的能力。在小鼠原发性 BMDMs 中，DI 处理会上调 ATF3，从而抑制 IκBζ 驱动的炎症反应。NRF2-KO BMDMs不能抑制DI诱导的IκBζ和IL6下调，这表明衣康酸/ATF3/IκBζ轴与NRF2无关。重要的是，BMDMs 中的 ATF3-KO 恢复了 IκBζ 蛋白的表达和 DI 诱导的促炎 IL-6 上调，这表明 ATF3/DI 目标参与的目标途径是充分的。在 WT BMDMs 细胞中观察到的 ATF3 上调在 IRG1-KO 细胞中消失，这表明 ATF3 的激活依赖于 IRG1。TLR7/8-激动剂咪喹莫特（IMQ）诱导的银屑病小鼠模型进一步证实了 DI 对 ATF3-IκBζ 信号传导的调节作用。用 DI 治疗的小鼠的银屑病样皮肤改变明显减少，IMQ 诱导的 IκBζ 驱动基因的 mRNA 表达也有所下降。

    顺/反几何异构体中康酸和柠康酸构成了衣康酸的结构异构体。导致这两种异构体形成的酶促过程和具体的生物环境还没有得到很好的描述。有限的证据表明，在取决于 pH 值、温度和特定离子或辅助因子存在的特定条件下，它们也可以通过非酶促性相互转化从衣康酸或其他 TCA 循环中间产物形成。它们在细胞裂解后、代谢物鉴别前的样品制备过程中（使用 MS 或 NMR 分析）自发异构化的可能性会使这些结果更加复杂。与衣康酸一样，中康酸和柠康酸也具有免疫调节、抗氧化和抗病毒特性。

    当以超生理浓度（25 毫摩尔，6 小时）引入 PMA 分化的 THP1 单核细胞时，所有三种异构体都会对新陈代谢产生不同的影响。显然，由于对细胞摄取效率的内在差异、细胞内潜在的自发或酶促相互转化、内源性生物合成和/或目标光谱的差异（见 “生物合成、代谢转化和‘自我调节’”）了解甚少，因此需要谨慎解释。例如，一种异构体处理对细胞无反应可能是由于其渗透性、生物利用率等降低，无法以足够的剂量到达某个目标/区域。在感染甲型流感病毒的 PMA 分化 THP1 和 A549 细胞中，发现所有三种异构体都能改变氨基酸代谢，调节细胞因子/趋化因子的释放，减少干扰素信号传导、氧化应激和病毒颗粒释放。

当用衣康酸或中康酸处理 RAW264.7 细胞或 LPS 刺激的 BMDMs 时，两种代谢物在降低糖酵解活性方面表现出相似的效果；然而，衣康酸能独特地抑制 TCA 循环和细胞呼吸。尽管存在这些代谢差异，但两者都能类似地调节促炎巨噬细胞的免疫反应，特别是下调 IL-6 和 IL-12 的分泌，同时上调 CXCL10 促炎趋化因子的分泌。据报道，在 HaCaT 角质细胞中以 10-25 毫摩尔剂量测定的三种异构体中，柠康酸是最强的NRF262 激活剂。虽然这三种异构体都会影响 KEAP1/NRF2/AR-途径，但柠康酸对 NRF2 及其下游基因（如akr1b10）的影响以及对巨噬细胞氧化应激的调节作用更为明显。不过，这些结果还需要进一步验证，以明确排除这些影响并非由渗透性、代谢易变性和生物利用度的固有差异造成的。尽管如此，迄今为止的现有数据表明，柠康酸很可能是通过竞争性结合，对 IRG1 的衣康酸生物合成产生独特的先天抑制作用。因此，柠康酸成为首个天然存在的 IRG1 抑制剂。

    富马酸盐--另一种新出现的重要转运体--是经典 8 步 TCA 循环的中间产物，由 SDH 酶从琥珀酸催化其生物合成。富马酸盐的炎症行为和治疗潜力近年来受到广泛关注。事实上，由富马酸盐衍生的几种阻断性亲电性药物，如 Tecfidera (DMF)、Vumerity 和 Bafiertam，最近已用于治疗自身免疫性疾病。富马酸盐的另一种衍生物--富马酸替比拉胺--用于治疗银屑病，最近也完成了 II 期临床试验。富马酸盐被称为免疫代谢物以外的代谢物，因为它的积累与肿瘤的演变有关。例如，负责将富马酸转化为（S）-苹果酸的富马酸酶编码fh基因突变是 TCA 循环的后续步骤，它与遗传性白血病和肾细胞癌（HLRCC）综合征有关。正在进行的（前）临床研究还旨在将 DMF 重新用于多发性硬化症以外的疾病，例如 皮肤 T 细胞淋巴瘤（CTCL）（II 期）、阻塞性睡眠呼吸暂停（II 期）、颅内未破裂动脉瘤（IV 期，进行中）、心肌病（心肌梗塞，临床前）和其他神经退行性疾病（帕金森病和阿尔茨海默病，临床前）。DMF 还与其他疗法联合用于疾病治疗，如与阿替普酶联合治疗急性缺血性中风77（I/II 期），与替莫唑胺和放射疗法联合治疗多形性胶质母细胞瘤（I 期）。

    与所有具有广谱细胞毒性的 RES 一样，剖析富马酸盐（或 DMF/相关类似物）的靶上 MoA 也是一项重大挑战。尽管在药物批准时，DMF 的临床作用机制被描述为 KEAP1 的共价吸附，从而引起 NRF2/AR 的上调，但随后的一项里程碑式的研究表明，DMF 诱导的治疗结果在 NRF2-KO小鼠中得以维持，从而排除了 NRF2/AR 途径作为基因上充分/必要作用机制的可能性。随后发表的许多论文都集中于发现有别于 KEAP1/NRF2/AR 级联的新靶点和通路，以更好地解释 DMF MoA。然而，通过对已发现的靶点进行 KD/KO 以及熏蒸/DMF-bolus 给药方法进行类似的基因充分性测试，并未发现功能充分的参与者。这些有趣的开创性研究已被详细综述。

    耐人寻味的是，鉴于 NRF2/AR 是细胞存活/增殖所需的核心细胞保护途径，DMF 的临床细胞杀伤作用--尤其是免疫细胞--似乎相互矛盾。为了解决这一制药学上的二分法，我们实验室开始利用内部开发的精确亲电子信号检测技术（T-REX）。T-REX 可以按需在体内对特定的亲电子感应蛋白进行亲电子修饰，而细胞/动物则基本不受干扰。[展望 "描述了基本的技术概念]。利用 T-REX 向 KEAP1 运送特定的活性代谢物，我们发现了一种新的由亲电子诱导的先天免疫细胞选择性丧失，这种丧失是由 KEAP1/Wdr1 介导的线粒体靶向凋亡信号驱动的，其重要性从人类、小鼠到鱼类都是一致的。

    这一途径的发现完全得益于 T-REX。然而，如果该通路是先天性免疫细胞独有的DMF基因和功能充足的MoA，那么该模型在药理学（全细胞/动物DMF）处理下也应成立。与这一假设相一致的是，在给予非细胞毒性量（25-50 μM，4-6 小时）的 DMF 后，活斑马鱼和原代小鼠 BMDMs 中的 Wdr1 缺失会消减药物（DMF）诱导的先天免疫细胞耗竭，而野生型对照组中也能观察到这种情况。这种新型途径/MoA 具有选择性的化学类型特异性：除 DMF 外，短链内源性 LDEs（如 4-羟基壬烯醛）会促进这种细胞类型特异性行为，而长链 LDEs（如 4-羟基十二烯醛）则不会。这一点耐人寻味，因为所研究的所有化合物都能与 KEAP1 共价结合（并能促进 NRF2）。KEAP1/Wdr1 轴的必要性也可能解释了为什么 NRF2-KO 小鼠仍然支持 DMF 诱导的反应。DMF 在多个位点标记 KEAP1（C151、273、288）。幸运的是，由于三重Cys突变体KEAP1（C151S,C273W,C288E）能够保持野生型KEAP1的典型功能，而且仅有DMF-亲电体感应特性缺陷，因此诱变方法仍然是一条可行的验证途径。能够在特定的反应配体化学型、特定的靶点（和结合位点）以及在特定的局部/细胞类型中运行的特定途径之间建立精确的关系，同时避免其他细胞类型的损伤并保持细胞/动物的整体生长/活力，有望实现转化效益。

蛋白质 target ID

    基于活性的竞争性蛋白质分析（ABPP）及其变体于 2000 年代初首次被报道，是一种古老的高通量方法，用于对给定小分子配体（LOI）的潜在蛋白质靶点进行定量排序。ABPP 中的 “命中识别 ”依赖于使用亲电探针（通常是碘乙酰胺-炔（IAA））进行间接读数。与未经过 LOI 处理的样本相比，细胞裂解物（来自经过 LOI 处理的细胞/动物样本）中失去 IAA 连接的蛋白质被记为命中。IAA 信号按照基于富集的蛋白质组学工作流程进行分析。ABPP 已应用于免疫相关实例，其中 LOI 是一种免疫代谢物，如富马酸，或相关药物，如DMF。例如，富马酸盐在基于细胞的 HLRCC 模型中的 ABPP 靶标识别揭示了富马酸盐与其靶标反应的细微差别，这种反应受 pH 值等理化因素的影响（另见 “富马酸盐”）。

    此外，ABPP 还创新性地适用于从LOI 库中对化合物进行高通量鉴定。这一平台变体最近被应用于识别可调节 T 细胞活化的LOI。最近另一项有趣的研究捕捉了衣康酸的潜在靶标，涉及一种新的基于碳水化合物的半胱氨酸反应性阻断试剂--3,4,6-O-Ac3ManNAz。在 RAW264.7 细胞中发现了 260 个对衣康酸有反应的潜在蛋白质半胱氨酸。进一步研究发现，衣康酸可修饰糖酵解酶，如 ALDOA、GAPDH 和 LDHA，从而抑制糖酵解--这一过程在 M1-巨噬细胞中显著上调。糖酵解抑制可减轻 LPS 刺激的 RAW264.7 细胞的炎症反应。

    除蛋白半胱氨酸外，ABPP 还可用于筛选原代人外周血单核细胞（PBMCs）在 LPS 刺激下可能配体的蛋白赖氨酸。戊炔酸硫四氟苯（STP）酯被用作间接赖氨酸反应的代理亲电探针。尽管在免疫相关靶标定位方面取得了这些进展，但基于 ABPP 方法的一般局限性也延伸到了这些方案中。与分区特异性和/或低占位性靶标识别相关的内在障碍、读出的间接性（在细胞溶液中进行代理亲电探针的靶标捕获）构成了一些尚未解决的关键挑战。

    直接捕获经 mt-REM 修饰的靶标通常需要注意 MS 工作流程和样品处理，这是因为所产生的加合物（尤其是通过逆迈克尔加成法，捕获的基于半胱氨酸的加合物）具有不稳定性。迄今为止，直接绘制 mt-REM 靶点的方法可分为基于抗体的方法和利用可点击的 mt-REM 类似物的方法。后者需要用（修饰的）mt-REMs充斥细胞，而前者则因缺乏针对单个mt-REMs的化学特异性抗体而受到限制。

    在第一种方法中，一项使用抗琥珀酰赖氨酸抗体的研究报告称，在 LPS 刺激小鼠原代BMDMs 后，琥珀酰化蛋白（称为富马酸修饰蛋白）增加。随后进行的基于免疫沉淀的富集蛋白质组学靶标识别显示，MDH、GAPDH、GC1、LDHA 和 TAL 等是富马酸盐的潜在靶标（但这些修饰是否与功能相关还需进一步研究）。另一项研究利用了抗琥珀酰赖氨酸抗体在伊它康酸化蛋白潜在靶标识别中的杂合性。通过基于选择反应监测的 LC-MS/MS 分析，向 LPS 激活的巨噬细胞补充外源性衣康酸（10 mM）会导致衣康酰基-CoA 水平的上调。有报道称，多种蛋白质（如 GAPDH、ENO1、PKM2 LDHA、NPM1、H2B1B 和 SHMT2）发生了衣康酸化，但功能性研究仍然有限。值得注意的是，为了减轻使用抗琥珀酰赖氨酸抗体鉴定衣康酸化蛋白质组的困难，作者们经过深思熟虑，尝试制备抗衣康酸化赖氨酸抗体，但迄今为止抗体的亲和力不足阻碍了其应用。

    第二种方法通常是在 mt-REMs 中安装可点击的把手（通常是炔基），同时进行额外的结构修饰，以提高细胞渗透性、生物利用率和/或所修饰类似物的代谢稳定性。因此，炔功能化探针正在迅速出现，尽管这些类似物在模拟衣康酸方面的局限性现已得到充分报道。4-OI 的炔基整合版本（ITalk）是最近报道的一种可点击探针，用于直接分析潜在靶标。修饰-位点-ID 是通过苯胺衍生探针捕获残余蛋白质-羰基推断出来的。这种直接捕获的策略避免了间接靶标识别的局限性；但是，需要注意的是，羰基功能可能来自蛋白质的几种内源性 RES 修饰，如 LDE，其程度可能因处理样本和未处理样本而异。

    重要的是，在所研究的情况下，全细胞 ITalk/4-OI 处理再现了衣康酸刺激后观察到的抗炎行为。下游研究发现，通过 RIPK3（S232）磷酸化激活的 RIPK3 激酶与衣康酸和 4-OI 均可诱导的坏死细胞死亡有关。虽然蛋白质组学的位点-ID 将 ITalk-烷基化映射到 RIPK3 的 3 个半胱氨酸上，但诱变研究表明，这种信号传导在功能上需要 RIPK3（C360）特异性烷基化。虽然结构类似物的使用促进了我们对 mt-REMs 预期靶标谱的了解，但认识到潜在的隐患也至关重要。首先，类似物可能无法完全再现 mt-REMs 的自然行为。其次，正如 ITalk 的开发人员深思熟虑地描述的那样，延长烷基链等重大结构修饰可能会影响目标结合效率。这些差异可能会进一步改变亚细胞分布、渗透性、代谢易损性以及内在亲电性等，从而导致捕获的靶标不同，而诱导的生物效应也各不相同。严格的验证实验--例如，在基因敲入（KI）Cys 突变细胞系中消减测量输出--对于准确解读 MoA 至关重要。

通过精准的局部亲电子递送绘制功能引导的邻近性图谱

    显然，上述两种分析方法都极大地推动了这一领域的发展。然而，这两种方法都依赖于向细胞/机体大量施用反应性代谢物，因此提供的时空分辨率有限。已知能驱动 GOF/dLOF nE-PTM 信号转导的低占位亲电子传感器和局部特异性动力学反应物往往无法识别。在使用批量给药对不同的 RES 化学型进行比较时，应谨慎行事，因为细胞摄取、扩散、生物利用度和每个反应实体的代谢脆弱性程度的差异可能会导致输出结果出现偏差。在新陈代谢活跃的复杂活体动物中研究功能影响时，这些问题会更加严重。

    生物相容性光凝胶嗜电子体的开发--精确定位嗜电子体递送概念和相关的 REX 技术--提供了一种补充方法，可以解决上述局限性。REX 技术适用于各种活体模型（细胞、蠕虫、鱼类），利用 Halo 蛋白，以细胞/器官特异性和亚细胞/细胞器特异性的方式进行功能表达。在施用生物惰性和细胞/动物可渗透的 REX 探针以及冲洗期后，REX 探针以 1:1 的比例不可逆地与 Halo 结合。在预先设定的时间内进行光照射，可使亲电子释放迅速（t1/2< 1 分钟）。这种方法模拟了自然界在局部时空背景下建立内源亲电子体的过程。在指定的 Halo 位置内瞬时提供的有限数量的亲电子物质，会被 Halo 附近的本地亲电子感应蛋白竞争。将这种以亲电蛋白功能为导向的近端图谱平台（Localis-REX）与富集-蛋白质组学工作流结合起来，就能在具有动力学优势的本地响应者中进行定量目标识别/分级。最近，Localis-REX 的一个实例展示了细胞核与线粒体外膜特异性精确定位递送脂质信号嗜电子物（LDEs）。

    利用这种设置，该方法可以精确定位蛋白质在非主要驻留区的特异性 LDE 反应。例如，主要驻留在细胞核中的激酶 CDK9 只有在反应性代谢物进入细胞质时才会对 LDE 产生独特的反应。使用上述依赖于大量给药的分析工具，不容易识别出这种在非标准位置执行 “少数感应 ”的低丰度亲电子感应蛋白。值得注意的是，给药的位置特异性与活性化合物的扩散距离有内在联系。与新出现的创新性近端测绘工具中使用的合成自由基和碳化物不同，LDEs 会经过内源性代谢清除/转化：如谷胱甘肽共轭、GST 介导的解毒/降解等，这些都已作了综述。因此，LDEs 的扩散距离取决于具体情况。尽管如此，利用仅限于细胞核的 Halo 进行的 Localis-REX 分析显示，62% 的典型核居民支持从 Localis-REX 释放的 LDE 在很大程度上是定位的。有趣的是，剩下的几个命中蛋白--通常不与细胞核相关的蛋白--经功能验证也具有细胞核特异性 LDE 感知能力。

    与所有蛋白质组学靶标图谱绘制方法一样，机理研究对于全面了解新捕获的第一反应蛋白的作用至关重要。令人欣慰的是，其他所有蛋白质组学分析方法都是终点检测，即一旦捕获了靶标，就需要进行不同类型的功能检测来验证，而 Localis-REX 与之不同，它不是一种终点 Omics 检测。这是因为它可以与姊妹技术 T-REX（下文将进一步讨论）同时进行，T-REX 可同时进行靶点验证和靶点信号检测。这种串联 Localis-REX-T-REX 机制工具揭示了 CDK9 细胞质池编排的少数活性代谢物传感能力如何下调核特异性 RNA-Pol-II 介导的转录调控。CDK9 的核池无法感知 LDE，因为其感知半胱氨酸位点被核驻留粘合剂 CyclinT 所阻断。

    因此，Localis-REX 为现有的化学蛋白质组学分析和邻近性映射 omics 策略提供了补充解决方案。不过，值得注意的是，这种方法需要精心的设计和工程。光笼型 REX 探针需要针对特定的亲电反应物类别量身定制新型生物相容性化学物质，这超出了一般的要求：无毒性、渗透性、代谢稳定性、光诱导效率等。实施生物兼容的化学-生物学/化学-遗传学工作流程需要全新的开发，特别是在复杂的活体动物中。事实上，在采用 REX 技术之前，Halo 在体内的功能尚未确立。REX 探针在体内的 Halo 结合特异性也必须得到优化，同时不影响动物的存活/形态/发育。遗憾的是，已发表的光笼化亲电探针只能将烯醛/烯酮作为反应主题。例如，光固化-4-氧代壬烯醛（ONE）在光固化之前就具有广谱反应性，这一点不足为奇。目前，我们实验室正在采用创新的生物兼容方法来调整 REX 技术，并实现 Localis-REX mt-REM 引导的近距离图谱绘制。

mt-REMs 的潜在生物传感技术

    基因编码生物传感器（GEB）在监测和报告各种细胞小分子代谢物方面历来被证明非常有用。这些生物传感器根据其结构分为集成系统（生物传感器是相关蛋白质或 DNA/RNA 的一部分）和独立系统。具有高特异性的 GEB 能够实时报告特定代谢物的动态。然而，GEB 的稳定性和潜在侵袭性等问题需要逐一解决/优化。相反，基于小分子的传感器提供了另一种方法，可以补充 GEB，检测细胞内的特定代谢物或离子。但与可编码大量定位标签的 GEB 相比，基于小分子的生物传感器的定位特异性控制通常较差。

    部署用于共价反应代谢物（如 LDEs、mt-REMs）的生物传感器需要考虑一些关键因素。由于是共价吸附，因此一旦已有的生物传感器分子与配体结合，GEB 就无法进一步报告，这就限制了其更广泛的适用性。配体结合/解结合事件的即时报告--不受可能影响结合/解离平衡kon/koff/Kd的微环境变化的影响--也可能难以实现。与此相反，基于小分子的具有化学型特异性的 mt-REMs 生物传感器一般也很难实现，因为有许多基于内源迈克尔受体的 RES，如LDE。这种传感器还需要与 5-10 毫摩尔的细胞GSH4 竞争。重要的是，在 “感知 ”特定代谢物的过程中，细胞代谢物池的捕获和耗竭会在多大程度上改变局部可用性，并导致非生理转运动态的伪报告，这些都需要仔细评估。

    最近，一种基于荧光蛋白的衣康酸 GEB--BioITA--浮出水面。BioITA 源自细菌转录调控蛋白 ItcR 的衣康酸结合域 (IBD)。在 LPS 刺激后，RAW264.7 细胞亚细胞区的荧光开启可实时报告衣康酸的上调。移除衣康酸后信号的减少证实了 BioITA 与衣康酸的结合是可逆的；此外，信号可通过重新添加衣康酸而恢复。等温滴定量热法（ITC）测得 BioITA 的Kd为 203 ± 18.8 µM。

对反应性代谢产物引导的 nE-PTM 信号转导进行精确研究

    在活性代谢物信号生物学的更广阔领域中，精确触发靶标特异性亲电修饰的能力为精确的亲电驱动 GOF/dLOF nE-PTM 信号转导打开了一个直接的视角。这种工具被称为 T-REX。T(Z)-REX 与 Localis-REX（“通过精确定位的亲电子递送进行功能引导的邻近图谱绘制”）一样，以精确定位的反应性代谢物递送为核心原则，已被证明可在培养细胞和活生物体（秀丽隐杆线虫和斑马鱼）中使用（即 Z-REX，表示斑马鱼中的 T-REX）。Localis-REX 与 T-REX 在技术上的唯一区别是使用了 Halo 融合 POI。T(Z)-REX 将特定的反应性代谢物传递到特定的 POI 上，并对 POI 对特定亲电子体的定量反应性（即配体占有率）以及关键的信号传播机制产生的影响进行检测。通过一系列技术和功能控制，可以区分靶上后果与脱靶/与约 20 万个其他独特的蛋白质半胱氨酸和其他亲核蛋白质残基接合可能产生的后果。Z-REX 最近适用于在转基因斑马鱼中绘制器官特异性 LDE 反应图。心脏特异性 KEAP1-LDEylation 可选择性地上调心脏中的 NRF2/AR 轴，而不会上调其他组织/区域的 NRF2/AR 轴。这项实验不仅证明了 Z-REX 的特异性，还证明了它在无创、高时空精度地研究整个脊椎动物体内精确信号通路方面的潜力。正如本研究和其他在鱼类中进行的 Z-REX 研究所验证的那样，在整只动物体内注射 LDE，几乎不可能控制特定 LDE 何时到达心脏特异性蛋白质目标（以及到达的数量）；或者在代谢转化为其他活性物种/化学型之前是否到达，或者是否遇到内源性降解/清除途径，更不用说由于注射 LDE 引起的毒性而可能产生的假读数。如上所述，目前正在扩大 REX 工具的生物兼容化学空间，以整合一系列 mt-REM。

    在未来几年里，精准化学生物学工具与不断发展的单细胞测序和空间组学技术的功能性结合将有可能催生下一代精准免疫疗法。这些疗法的疗效将根据其在达到预期目标和结果方面的特异性来衡量，同时最大限度地减少有害的脱靶后果。针对免疫反应的代谢基础无疑将被证明是非常有用的。但这种进步取决于我们是否有能力在确定的生物环境、地点和时间范围内精确解读反应性免疫代谢物的生物效应，更关键的是，我们是否有能力为可化学作用的蛋白质靶点提供信息，这些靶点与特定的 mt-REMs 一起协调功能性信号反应。有了这样的认识，就能对代谢途径进行战略性操纵，从而有可能改变各种免疫系统疾病的预防和治疗方法。事实上，近年来，定量空间图谱的数量不断增加，这些图谱描绘了多方面免疫微环境中改变的（外）遗传学、（外）转录组学特征以及局部蛋白质组丰度/典型 PTM 的变化。如何将这种空间注释与局部特异性化学可操作性结合起来，仍然是本十年的关键挑战之一。利用时空智能解码 mt-REMs 和相关 nE-PTM 信号模式的强大免疫代谢作用是一个理想的利基。在这种情况下，精准免疫化学生物学工具大有希望带来独特的解决方案。