Chestnut Studying
摘要
Background: Neuroinflammation reportedly plays a critical role in the pathogenesis of sepsis-associated encephalopathy (SAE). We previously reported that circulating plasma extracellular vesicles (EVs) from septic mice are proinflammatory. In the current study, we tested the role of sepsis plasma EVs in neuroinflammation.
Methods: To track EVs in cells and tissues, HEK293T cell-derived EVs were labeled with the fluorescent dye PKH26. Cecal ligation and puncture (CLP) was conducted to model polymicrobial sepsis in mice. Plasma EVs were isolated by ultracentrifugation and their role in promoting neuronal inflammation was tested following intracerebroventricular (ICV) injection. miRNA inhibitors (anti-miR-146a, -122, -34a, and -145a) were applied to determine the effects of EV cargo miRNAs in the brain. A cytokine array was performed to profile microglia-released protein mediators. TLR7- or MyD88-knockout (KO) mice were utilized to determine the underlying mechanism of EVs-mediated neuroinflammation.
Results: We observed the uptake of fluorescent PKH26-EVs inside the cell bodies of both microglia and neurons. Sepsis plasma EVs led to a dose-dependent cytokine release in cultured microglia, which was partially attenuated by miRNA inhibitors against the target miRNAs and in TLR7-KO cells. When administered via the ICV, sepsis plasma EVs resulted in a marked increase in the accumulation of innate immune cells, including monocyte and neutrophil and cytokine gene expression, in the brain. Although sepsis plasma EVs had no direct effect on cytokine production or neuronal injury in vitro, the conditioned media (CM) of microglia treated with sepsis plasma EVs induced neuronal cell death as evidenced by increased caspase-3 cleavage and Annexin-V staining. Cytokine arrays and bioinformatics analysis of the microglial CM revealed multiple cytokines/chemokines and other factors functionally linked to leukocyte chemotaxis and migration, TLR signaling, and neuronal death. Moreover, sepsis plasma EV-induced brain inflammation in vivo was significantly dependent on MyD88.
Conclusions: Circulating plasma EVs in septic mice cause a microglial proinflammatory response in vitro and a brain innate immune response in vivo, some of which are in part mediated by TLR7 in vitro and MyD88 signaling in vivo. These findings highlight the importance of circulating EVs in brain inflammation during sepsis.
背景：据报道，神经炎症在脓毒症相关性脑病（SAE）的发病机理中起着关键作用。我们之前曾报道过，脓毒症小鼠的循环血浆外泌体（EVs）具有促炎性。在本研究中，我们测试了脓毒症血浆外泌体在神经炎症中的作用。
方法：为了追踪细胞和组织中的外泌体，用荧光染料PKH26标记了HEK293T细胞来源的外泌体。通过盲肠结扎和穿刺（CLP）对小鼠进行多微生物脓毒症模型实验。通过超速离心分离血浆EV，并通过脑室内注射（ICV）测试其在促进神经元炎症中的作用。应用miRNA抑制剂（anti-miR-146a、-122、-34a和-145a）确定EV货物miRNA在大脑中的影响。通过细胞因子阵列分析小胶质细胞释放的蛋白介质。利用TLR7或MyD88基因敲除（KO）小鼠来确定EV介导的神经炎症的潜在机制。
结果：我们观察到荧光PKH26-EVs在小胶质细胞和神经元的细胞体内被吸收。脓毒症血浆EVs导致培养的小胶质细胞产生剂量依赖性的细胞因子释放，而靶向miRNA的miRNA抑制剂和TLR7-KO细胞则部分减弱了这一效应。当通过ICV给药时，脓毒症血浆EVs导致大脑中单核细胞和中性粒细胞等先天免疫细胞的积聚以及细胞因子基因表达显著增加。尽管脓毒症血浆EV对细胞因子产生或神经元损伤没有直接影响，但经脓毒症血浆EV处理的小胶质细胞培养基（CM）诱导神经元细胞死亡，表现为Caspase-3裂解和Annexin-V染色增加。小胶质细胞CM的细胞因子阵列和生物信息学分析揭示了多种细胞因子/趋化因子和其他与白细胞趋化和迁移、TLR信号传导和神经元死亡相关的因子。此外，脓毒症血浆EV诱导的体内脑部炎症明显依赖于MyD88。
结论：脓毒症小鼠体内的循环血浆EV可引起小胶质细胞的体外促炎反应和体内的脑部先天免疫反应，其中部分反应在体外由TLR7介导，在体内由MyD88信号传导。这些发现强调了循环EV在脓毒症期间脑部炎症中的重要性。
实验结果1
脑细胞对细胞外囊泡的吸收
为了追踪细胞和组织中的细胞外囊泡，作者用亲脂性荧光染料PKH26标记了HEK293T细胞来源的细胞外囊泡，并通过过滤去除游离的PKH26染料，纯化了PKH26-EVs（图1A）。然后，通过将RAW巨噬细胞和小胶质细胞与荧光标记的PKH26细胞外囊泡（图1A）一起培养，来研究细胞对细胞外囊泡的摄取。在这两种细胞中，PKH26-293EVs都被吞噬并定位在细胞质中（图1B、C，顶部面板）。作为对照，仅PKH26的红色荧光信号在细胞质内分布并不明显（图1B、C，底部面板）。在体内，作者测试了两种细胞外囊泡给药方法——ICV和IV注射，并测试了它们在大脑中的分布。PKH26-293EVs（8×10 8个颗粒）通过ICV直接注射到对照组小鼠的大脑中（图2A、B）。在注射后2小时和18小时评估细胞外囊泡信号，以捕捉动态变化。注射后2小时，与PBS对照组相比，在注射部位附近同时检测到F-肌动蛋白（紫色，细胞骨架的组成部分）和PKH26-293EVs（红色荧光）（图2A）。ICV注射18小时后，免疫组织化学染色显示，与细胞外囊泡共定位的细胞是小胶质细胞（Iba-1染色）和神经元（NeuN染色）（图2B）。细胞外囊泡与星形胶质细胞（GFAP标记）紧密接触（图2B）。为了测试细胞外囊泡是否通过血脑屏障渗透到大脑并定位在脑细胞中，作者通过尾静脉注射了PKH26-293EVs（2×10 9个颗粒）。注射后一小时，在Iba-1阳性小胶质细胞和NeuN阳性神经元内检测到红色信号，放大图像如图2C所示。与ICV注射一致，荧光标记的细胞外囊泡与GFAP阳性星形胶质细胞紧密接触，但很少出现在细胞体内（图2D）。这些体外和体内数据共同表明，循环或局部递送的细胞外囊泡可以穿过血脑屏障并进入各种脑细胞，包括小胶质细胞和神经元。
实验结果2
脓毒症血浆外囊泡通过 ICV 注射引起脑部炎症
为了确定循环中的脓毒症细胞外囊泡是否有可能诱导脑部炎症反应，按照之前的描述，在手术后 24 h 从 sham 或 CLP 小鼠体内分离出血浆 EVs，并用 Western 印迹法确认 CD81 和 CD9 的表达。流式细胞术分析表明，与注射 sham EVs 的小鼠相比，注射 CLP EVs 的小鼠脑内先天性免疫细胞数量显著增加（图3A）。这些免疫细胞包括 CNS 常驻小胶质细胞（50 ± 5.7 vs. 40.4 ± 4.9 ×10 4cells，p< 0.05；CLP EVs vs. sham EVs）和浸润的髓源性细胞（21.7 ± 3.7 vs. 11.4 ± 3 × 10 4 cells，p < 0.05；CLP EVs vs. sham EVs），单核细胞（15 ± 3 vs. 7.8 ± 2.6 ×104cells，p< 0.01）和中性粒细胞（20.1 ± 4. vs. 9.5 ± 2.3 ×103cells，p< 0.01）。同样，与 sham EVs 组相比，CLP EVs 组浸润的髓系细胞（CD11b+CD45high ）在脑细胞总数中所占的百分比也有所增加。值得注意的是，与假EVs组相比，CLP EVs组小胶质细胞（CD11b+CD45低）的相对比例有所下降（图3B，C），这很可能是由于髓系细胞等其他类型细胞的增加。在免疫细胞中，CLP EV 组单核细胞（Ly6C+Ly6G- ）的百分比显著高于假对照组（17.9 vs. 14.6%，p< 0.05），中性粒细胞（Ly6C+ Ly6G+ ）的百分比在 CLP EV 组也有所增加（2.9 vs. 1.4%，p< 0.05）（图3B、C）。为了检测注射脑中细胞因子基因的表达（图3D），作者分别提取了大脑皮层和海马的总 RNA。在大脑皮层，qRT-PCR分析显示，与sham EVs处理的动物相比，ICV注射CLP EVs显著增加了促炎细胞因子/趋化因子基因的表达，包括TNFα、IL1-β、IL-6和CXCL2。然而，在海马中没有观察到促炎细胞因子和趋化因子的增加。与细胞因子基因表达一致的是，接受 CLP 细胞外囊泡的小鼠单核细胞、中性粒细胞和小胶质细胞中 IL-1 β 和 TNFα 的蛋白水平显著增加（图3E）。这些数据共同表明，脓毒症小鼠的循环细胞外囊泡具有显著的促炎作用。
实验结果3
脓毒症细胞外囊泡激活培养的小胶质细胞并间接诱导神经细胞凋亡
为了探索血浆外囊泡的促炎特性，作者用 sham 和 CLP 血浆外囊泡处理了各种脑细胞，包括小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，并检测了它们的细胞因子/趋化因子反应。小胶质细胞对中电血浆 EVs 而非假 EVs（1 ×108~ 5 ×109EVs/mL）表现出明显的剂量依赖性 CXCL2 和 IL-6 生成增加（图4A）。相反，与假对照相比，用 CLP 细胞外囊泡处理星形胶质细胞时，星形胶质细胞没有细胞因子反应或反应非常轻微（图4B）。在神经元中，用剂量为 2.5 ×109EVs/mL 的 CLP 外囊泡处理后，CXCL2 和 IL-6 的产生略有增加（图4C）。值得注意的是，在神经元中观察到的这种增加仅是用相同浓度的 CLP 外囊泡（2.5 ×10 9EVs/mL）处理小胶质细胞时观察到的增加的一小部分。这并不奇怪，因为神经元具有免疫能力，但作者预计神经元的炎症反应不会像小胶质细胞等免疫细胞那样强烈。然而，神经元细胞死亡在 SAE 的病理生理学中起着关键作用。为了研究 CLP 细胞外囊泡是否会对神经元造成伤害，作者用 sham 和 CLP 细胞外囊泡处理培养的神经元，并检测细胞凋亡情况。如图5A-C 所示，CLP EVs 直接处理培养的神经元并不影响裂解的 Caspase-3 表达（图5B、C 左侧面板）。相反，与假对照组相比，用经 CLP 细胞外囊泡处理的小胶质细胞 CM 培养时，裂解的 caspase-3 表达量增加了两倍（图5B、C 右图）。值得注意的是，10 nM 的巴佛洛霉素 A1 被作为通过激活 Caspase-3 诱导细胞凋亡的阳性对照。此外，作者还观察到用 CLP-EV 处理过的小胶质细胞外囊泡处理过的神经元的 Annexin V-FITC 强度和 Annexin V 阳性更高（图5D），然而，这种增加并没有达到统计学意义（面积：105.9 vs. 60.2）： 105.9 vs. 60.2，p= 0.138；细胞数：43 ± 13 vs. 103 ± 18，p= 0.0755）。这些数据表明，CLP 细胞外囊泡可诱导小胶质细胞活化、炎症和神经细胞死亡。
实验结果4
脓毒症细胞外囊泡相关的 miRNA 部分通过 TLR7 促进小胶质细胞活化
为了确定脓毒症诱导的细胞外囊泡驱动小胶质细胞活化的机制，作者重点研究了细胞外囊泡携带的 miRNA。作者之前的研究发现了脓毒症血浆和 EV 中的一系列促炎 miRNA，如 miR-146a-5p、miR-122-5p、miR-34a-5p 和 miR-145a-5p ，以及它们在神经炎症反应中的作用。为了检验这些 miRNAs 在脓毒症 EVs 诱导的小胶质细胞活化中的作用，作者用靶向上述 4 个 miRNAs 的抗-miR 组合处理血浆 EVs，然后再将 EVs 与小胶质细胞培养。如图6A 所示，与对照寡核苷酸相比，用抗-miR 组合处理 EVs 可使 CLP EV 诱导的 CXCL2 生成水平降低 52%（209 ± 17.5 vs. 436 ± 12.4 pg/mL，p< 0.0013）。此外，由于作者之前已证明 miR-146a-5p、miR-122-5p、miR-34a-5p 和 miR-145a-5p 可通过 TLR7 诱导小胶质细胞活化，作者接下来探讨了 TLR7 在 CLP 细胞外囊泡激活的小胶质细胞中的作用。如图6B 所示，与 WT 相比，TLR7-KO 小胶质细胞中 CLP 细胞外囊泡诱导的 CXCL2 产量明显减少（173 ± 38.9 vs. 762 ± 91.9 pg/mL，p< 0.0001）。在分别用 R837（TLR7 激动剂）和 LPS（TLR4 激动剂）处理的两个重要对照组中，TLR7-KO 小胶质细胞对 R837 没有表现出 CXCL2 反应，而对 LPS 则保持了与 WT 小胶质细胞相似的反应，这证明了 TLR7 在 KO 小胶质细胞中的特异性功能缺陷。这些数据共同表明，脓毒症细胞外囊泡介导的小胶质细胞活化部分是通过其相关的 miRNA 和 TLR7 信号传导实现的。
实验结果5
条件培养基的细胞因子谱模式确定了导致神经元损伤的潜在效应因子
为了确定脓毒症细胞外囊泡处理的小胶质细胞条件培养基中导致神经元损伤的介质，作者进行了细胞因子阵列分析（图6C）。在测试的 111 种分子中，有 39 种分子在 CLP 细胞外囊泡处理的小胶质细胞的条件培养基中的含量比假组高 1.5 倍以上。这些分子包括各种细胞因子、趋化因子和生长因子（图6D）。前 10 位上调的蛋白是 E-选择素、IL-12 p40、脂钙蛋白 2（中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白）、MMP9（中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白）、NGAL（中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白）、IL-12 p40（中性粒细胞明胶酶相关脂钙蛋白 NGAL）、MMP9（基质金属肽酶 9）、CXCL2（趋化因子 C-X-C motif ligand 2）、CCL2（趋化因子 C-C motif ligand 2）、IGF-BP1（胰岛素样生长因子结合蛋白 1）、骨髓过氧化物酶（MPO）、Reg3G（再生胰岛衍生蛋白 3 γ）和 Resistin。
对所有上调分子进行的通路富集分析表明，基因本体（GO）生物过程术语包括 “白细胞迁移”、“粒细胞趋化 ”和 “髓系白细胞迁移”，这突出表明脓毒症细胞外囊泡激活了小胶质细胞。在分子功能方面，“细胞因子活性”、“受体配体活性”、“趋化因子活性 ”和 “补体C1q结合功能 ”等大部分富集的GO术语都与脓毒症EVs处理后小胶质细胞的促炎反应有关。京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，细胞因子/趋化因子信号通路（包括 TNFα 和 IL-17）和 Toll 样受体信号通路的上调次数较少，但具有统计学意义。为了进一步研究这些介质的功能特征，作者分析了与上调介质相关的 “细胞死亡”、“神经元”、“炎症反应 ”和 “先天性免疫反应 ”等 GO 成员术语，发现其中 33 个介质至少与一个 GO 术语相关（图6F）。在神经元（绿色）和细胞死亡（深蓝色）的重叠区域，作者发现了 LCN2（脂定位蛋白 2）、MMP9（基质金属肽酶 9）、CCL3（C-C Motif 趋化因子配体 3）、IL-10（白细胞介素 10）、ADIPOQ（脂肪连素）和 LEP（瘦素），这表明这些蛋白是介导 CLP 细胞外囊泡激活的小胶质细胞和神经元细胞死亡之间串联的潜在效应因子。最后，作者使用 Luminex 多重检测法对 8 种与神经元损伤相关的细胞因子和趋化因子进行了检测，验证了细胞因子阵列的部分研究结果。作者发现这些分子在脓毒症细胞外囊泡处理过的小胶质细胞培养物的培养基中明显增加（图6G）。
实验结果6
TLR7 和 MyD88 信号在脓毒症细胞外囊泡诱导的体内脑部炎症中的作用
接下来，作者采用功能缺失法研究了 CLP 细胞外囊泡诱导体内脑部炎症的信号通路。鉴于 TLR7 在体外有助于脓毒症-细胞外囊泡诱导的小胶质细胞活化（图6B），作者预计 TLR7 在体内对 ICV 注射脓毒症-细胞外囊泡的反应中也起着类似的作用。与假设不同，作者发现 TLR7 缺乏对脑免疫细胞（如小胶质细胞、髓样细胞、单核细胞和中性粒细胞）的数量（图7A、B）及其百分比没有影响，因为 ICV 注射 CLP 血浆 EVs 的剂量为 8 ×10 8/注射。与此相一致的是，接受 CLP EVs 的 WT 小鼠和 TLR7-KO 小鼠的大脑皮层中细胞因子基因表达没有差异（图7C）。有趣的是，作者观察到全身性的 MyD88 缺乏会减少 CLP 细胞外囊泡诱导的脑部炎症。如图8A-C 所示，与 WT 小鼠相比，MyD88 KO 小鼠在 ICV 注射 CLP 细胞外囊泡后，脑先天性免疫细胞（包括单核细胞和中性粒细胞）的数量明显减少。这既适用于数量，也适用于百分比。关于脑内小胶质细胞，MyD88基因敲除小鼠的小胶质细胞数量在统计学上显著减少了约41%，尽管各组间的百分比保持不变。此外，在 MyD88 基因缺陷的小鼠大脑中，细胞因子阳性表达的免疫细胞数量也减少了（图8D、E）。这些细胞包括表达 IL-1β 的小胶质细胞、单核细胞和中性粒细胞以及表达 TNFα 的中性粒细胞。重要的是，与接受CLP外囊泡的WT小鼠相比，MyD88KO小鼠皮质和海马中Il-1β、Tnfα和Cxcl2等细胞因子基因的表达明显减少（图8F）。
