Chestnut Studying
摘要
Polymorphonuclear neutrophil (PMN) infiltration at inflammatory site plays a critical role in inflammation. PMN reverse migration (rM) describes the phenomenon that PMNs migrate away from inflammatory site back into the vasculature, and its role within inflammatory scenarios remains to be fully determined. This study aimed to investigate the mechanism underlying PMN rM and its role in inflammation. First, we demonstrated PMN rM in a mouse model of lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation. By single-cell RNA sequencing, we demonstrated that reverse migrated (rM-ed) PMNs in blood expressed a high level of immune-responsive gene 1 (Irg1), the encoding gene of cis-aconitate decarboxylase (ACOD1). Using a mouse air pouch model, which enabled us to directly track rM-ed PMNs in vivo, we detected higher expression of ACOD1 in the rM-ed PMNs in circulation. Furthermore, mice with Irg1 knockout exhibited decreased PMN rM and higher levels of inflammatory cytokine in inflammatory site. Mechanistically, we found that itaconate, the product of ACOD1 catalyzation, decreased PMN ICAM-1 expression at the inflammation site. Furthermore, inflammatory site showed a high level of shed Cd11a, the ligand of ICAM-1. Neutralization of either ICAM-1 or Cd11a led to increased PMN rM. These findings suggest that the binding of ICAM-1 and shed Cd11a serves as a retaining force to hold PMNs in the site of inflammation, and ACOD1-decreased PMN surface expression of ICAM-1 weakens the retaining force, promoting PMNs to leave the inflammatory site. These results indicate a regulatory role of IRG1 in PMN rM and subsequent contributions to inflammation resolution.
炎症部位的多种形态中性粒细胞（PMN）浸润在炎症中起着关键作用。 PMN逆向迁移（rM）描述了PMN从炎症部位迁移回血管的现象，其在炎症中的作用仍有待充分确定。本研究旨在探讨PMN rM的潜在机制及其在炎症中的作用。首先，我们在脂多糖诱导的急性肺炎症小鼠模型中证实了中性粒细胞逆向迁移。通过单细胞RNA测序，我们证实血液中的逆向迁移（rM-ed）中性粒细胞表达高水平的免疫反应基因1（Irg1），即顺式乙酰辅酶脱羧酶（ACOD1）的编码基因。我们使用小鼠气囊模型，直接追踪体内rM-ed PMN，发现循环中的rM-ed PMN中ACOD1的表达水平更高。此外，Irg1基因敲除的小鼠体内rM-ed PMN减少，炎症部位的炎症细胞因子水平更高。从机理上讲，我们发现ACOD1催化产物衣康酸可降低炎症部位的PMN ICAM-1表达。此外，炎症部位还显示出高水平的外排Cd11a，即ICAM-1的配体。中和ICAM-1或Cd11a都会导致PMN rM增加。这些发现表明，ICAM-1和脱落Cd11a的结合就像一种保持力，将中性粒细胞固定在炎症部位，而ACOD1减少中性粒细胞表面ICAM-1的表达会削弱这种保持力，促使中性粒细胞离开炎症部位。这些结果表明IRG1在PMN rM中具有调节作用，并随后有助于炎症的消退。
实验结果1
rM-ed PMNs中Irg1表达上调
图1A显示了腹腔注射LPS后血液和BALF中中性粒细胞的变化。腹腔注射LPS后24小时，血液和BALF中的中性粒细胞显著增加。在该小鼠急性肺炎症（ALI）模型中，作者观察到腹腔注射LPS后24小时循环血液中rM-ed中性粒细胞增加（图1B）。rM-ed PMNs被定义为ICAM-1高CXCR1低，这是公认的rM-ed PMNs标记。23为了表征rM-ed PMNs，作者在LPS i.t.后0、6和24小时收集了WT小鼠的BALF和血液，并从BALF和血液中分离出白细胞进行scRNA-seq分析。下游分析共纳入了来自30324个细胞的21326个基因，并根据转录组将这些细胞分为18个簇。根据已发表的转录标记，确定了主要免疫细胞类型：中性粒细胞（Csf3r）、巨噬细胞（Ear2）、单核细胞（Ccr2）、树突状细胞（Flt3）、T细胞（Trbc2）、B细胞（Cd79b）和自然杀伤细胞（Gzma）。进一步分析表明，中性粒细胞可分为5个簇。作者发现，与人类细胞相比，小鼠中性粒细胞中的CXCR1表达较低，因此，根据血液中性粒细胞中Icam1的表达，作者将Icam1阳性中性粒细胞确定为rM-ed中性粒细胞，将Icam1阴性中性粒细胞确定为常驻中性粒细胞。rM-ed PMNs在Irg1表达和其他炎症反应相关基因中表现出显著增加（图1C、D）。
为了直接追踪rM-ed PMNs并确认观察结果，作者应用了气囊模型。如“方法”所述，将细胞追踪剂CMFDA注入气囊，以标记气囊中的PMNs。然后通过流式细胞术测量血液中CMFDA染色的中性粒细胞，即rM-ed PMN。为了确定CMFDA渗漏到血液中是否会导致血细胞在LPS刺激下染色，作者将LPS注入气囊，以诱导局部中性粒细胞浸润24小时，然后用PBS彻底冲洗气囊，直到在冲洗液中检测不到细胞。然后，作者将CMFDA注入气囊，并在注入后6小时，使用流式细胞仪检测血液中CMFDA阳性细胞。如图补充图3所示，在此实验条件下未检测到血液中CMFDA阳性细胞。这一结果表明，CMFDA并未扩散到循环系统中，并且染色循环中的中性粒细胞，血液中CMFDA阳性中性粒细胞主要代表rM-ed中性粒细胞。与血液中的常驻中性粒细胞相比，rM-ed PMNs（7AAD-Cd45+Ly6g+FITC+）中Irg1编码蛋白ACOD1的表达水平更高（图1E）。
实验结果2
ACOD1表达的增加可促进中性粒细胞活化并缓解局部炎症
为了确定ACOD1在PMN rM中的作用，Irg1基因敲除小鼠接受了气囊模型实验。如图2A所示，与野生型小鼠相比，Irg1缺陷小鼠在LPS处理后24小时血液中rM-ed PMN的比例显著降低。此外，Irg1基因敲除小鼠在LPS处理后的气囊灌洗液中显示出更高的炎症细胞因子和白细胞计数水平（图2B），表明PMN rM的减少与局部炎症的增加有关。先前的研究表明，ACOD1通过其催化产物衣康酸在感染和炎症中发挥抗炎作用。为了直接测试衣康酸在PMN rM中的作用，作者在注射LPS后24小时向气囊注射DI，并在注射DI（或PBS作为对照）后6小时收集血液以检测rM-ed PMN。作者发现，DI治疗显著提高了血液中rM-ed PMN的比例（图2C）。作者还观察到，在小鼠ALI模型中，经腹腔注射DI可显著减少BALF中的中性粒细胞（7AAD-Cd45+Ly6g+）（图2D），而巨噬细胞比率则增加。BAL PMN的减少与BALF中肿瘤坏死因子α和白细胞介素-6浓度的降低有关（图2E）。
实验结果3
ACOD1调节PMN ICAM-1的表达
为了研究ACOD1调节PMN rM的机制，作者分离了骨髓PMN，并在体外用LPS和/或DI处理6小时后测量了PMN表面趋化相关分子的表达，包括CXCR1、CXCR2、Cd11b和ICAM-1。LPS上调了PMN表面Cd11b和ICAM-1的表达，并略微降低了CXCR2的表面表达。然而，DI处理可防止LPS诱导的ICAM-1上调（图3A）。时间进程研究表明，在LPS刺激后3、6和12小时，DI可显著减少ICAM-1阳性中性粒细胞（图3B）。相比之下，Irg1基因敲除小鼠在LPS处理后ICAM-1阳性中性粒细胞增加（图3C）。
实验结果4
炎症部位的PMN ICAM-1表达减少，促进PMN rM
为了确定ICAM-1在调节PMN rM中的作用，作者在LPS处理后24小时向气囊内注射抗ICAM-1中和抗体，并在6小时后追踪血液中rM化的PMN。结果表明，ICAM-1的中和增加了血液中rM-ed PMN的数量（图4A）。作者进一步发现，与保留在炎症部位的PMN相比，血液中的rM-ed PMN表现出较低的ICAM-1表达（图4B）。这一发现也概括了ALI模型。如图4C所示，虽然rM-ed PMNs上的ICAM-1表达仍高于血液中常驻PMNs上的ICAM-1表达，但rM-ed PMNs上的ICAM-1表达低于BALF中肺泡PMNs上的ICAM-1表达。这些结果表明，炎症部位的PMN ICAM-1表达降低会促进PMN rM的形成。
实验结果5
减少ICAM-1和shed Cd11a的结合可促进PMN rM
基于之前显示的PMN表面表达的ICAM-1在调节PMN rM方面的重要作用，我们推测PMN ICAM-1与其配体在炎症部位的结合可作为阻止PMN rM的保留力。LFA-1（由Cd11a和Cd18组成的异二聚体）和Mac-1（由Cd11b和Cd18组成的异二聚体）是ICAM-1的主要配体。25 我们测量了PMN表面上的Cd11a、Cd11b和Cd18及其在炎症部位的游离形式。在气囊模型中，我们发现PMN表面Cd11b和Cd18的表达在气囊中显著上调，而PMN表面Cd11a的表达则下降（图5A）。这些发现也适用于ALI模型。如图5B所示，BAL PMN表面表达的Cd11b和Cd18显著上调，而Cd11a的表面表达则下降。然而，在LPS处理后24小时，气袋灌洗液和BALF中裂解的游离形式Cd11a的浓度显着增加（图5C），而在气袋灌洗液和BALF中未检测到游离形式的Cd11b和Cd18。为了证实中性粒细胞表达的Cd11a对LPS刺激的动态反应，我们在体外用LPS处理骨髓中性粒细胞，并测量了中性粒细胞表面整合素表达的动态变化。如图5D所示，中性粒细胞表面表达的Cd11a、Cd11b和Cd18在LPS处理后增加。综上所述，我们的研究结果支持PMN Cd11a脱落发生在PMN跨内皮迁移到炎症部位之后。26为了测试游离Cd11a在炎症部位保留PMN中的作用，我们将抗Cd11a中和抗体注入气囊，发现中和Cd11a增加了血液中rM-ed PMN的数量（图5E）。
