江南大学代谢工程改造大肠杆菌高效合成L-异亮氨酸

科技 2024-12-19 16:30 上海

在医学、食品和饲料领域，L-异亮氨酸作为一种重要的支链氨基酸，其生产和应用一直受到广泛关注。传统上，谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为主要的生产菌株，其L-异亮氨酸的生产效率已经得到了显著提升。然而，大肠杆菌(Escherichia coli)在自主高效生产L-异亮氨酸方面尚未有报道。

图1. 通过代谢工程和群体感应系统动态调控实现大肠杆菌中L-异亮氨酸高效生产

2024年12月16日，来自江南大学生物工程学院的王小元教授在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Metabolic Engineering of Escherichia coli for Self-Induced Production of l-Isoleucine”的研究论文，该团队通过结合代谢工程与细菌群体感应技术开发了一种生产策略，旨在提高大肠杆菌中L-异亮氨酸的产量。研究人员首先通过过表达ilvIH1、CgilvA1和ygaZH基因增强了L-异亮氨酸合成途径。接着，通过敲除rhtC基因增加了前体供应，同时敲除livJ基因以最大化L-异亮氨酸的积累。最终，通过人工群体感应系统实现了大肠杆菌中L-异亮氨酸的高效生产，并通过发酵过程中的自我调节实现了自我诱导蛋白表达。研究中使用的出发菌株为大肠杆菌TWF106，最终菌株TWF127/pST1011, pST1042-IH1ZHA1获得了49.3 g/L的L-异亮氨酸产量，产率为0.32 g/g葡萄糖，生产率为1.03 g/(L·h)。这一无需添加诱导剂的自主生产策略不仅提高了产量，也为多种天然产物的工业应用提供了可能性。

图2. 在大肠杆菌中异源表达CgilvA1和CgilvBN2对L-异亮氨酸生产的影响

研究人员首先在大肠杆菌TWF106中异源表达CgilvA1和CgilvBN2基因，其中，与对照菌株相比，TWF106/pB-BN2A1菌株在30小时发酵后能够产生1.9 g/L的L-异亮氨酸。然而，这一产量并不高，因为发酵过程中产生的2-氧丁酸(2-OBA)没有得到及时的利用，影响了L-异亮氨酸的进一步产量提升。此外，TWF106/pB-BN2菌株在发酵过程中大量积累了L-苏氨酸而非L-异亮氨酸，这可能是由于重组菌株中缺少CgilvA1基因，导致细胞内L-苏氨酸无法转化为2-OBA。这些结果表明，虽然异源共表达CgilvA1和CgilvBN2可以在大肠杆菌中产生L-异亮氨酸，但由于2-OBA的积累和利用效率不高，导致L-异亮氨酸的产量未能显著提高。

图3. 在大肠杆菌中过表达ygaZH基因增强L-异亮氨酸外排对提高产量的作用

由于ygaZH基因编码的L-异亮氨酸转运蛋白对L-异亮氨酸的细胞外积累有显著影响，研究人员在大肠杆菌TWF106中过表达ygaZH基因。通过将ygaZH基因插入到不同的质粒位置并进行过表达，研究发现所有工程菌株相较于对照菌株都能产生L-异亮氨酸，其中TWF106/pBBN2ZHA1菌株的产量最高，达到了2.9 g/L，比TWF106/pB-BN2A1菌株高出53%。这一结果证实了过表达ygaZH能成功增强L-异亮氨酸的细胞外转运，从而增加其产量。同时，L-苏氨酸和2-OBA在不同菌株中有不同的积累程度，其中TWF106/pB-BN2A1ZH菌株两者积累最高，导致L-异亮氨酸产量最低。

图4. 在大肠杆菌中过表达ilvIH1和ilvA2基因对L-异亮氨酸合成路径的影响

接下来，研究人员在大肠杆菌TWF106中过表达ilvIH1和ilvA2，其中，ilvIH1基因编码的是抗L-异亮氨酸反馈抑制的乙酰羟酸合酶，而ilvA2基因编码的是苏氨酸脱水酶。通过构建多个生产质粒并进行发酵实验，研究发现TWF106/pB-IH1A1和TWF106/pBIH1ZHA1菌株的L-异亮氨酸产量显著增加，其中TWF106/pB-IH1ZHA1菌株从30 g/L葡萄糖中能产生6.0 g/L的L-异亮氨酸，比TWF106/pB-BN2ZHA1菌株高出107%，并且细胞外只有少量的2-OBA积累。这表明过表达ilvIH1能有效地解决2-OBA积累问题，使2-OBA得到有效利用，从而显著增加L-异亮氨酸产量。然而，TWF106/pB-IH1A2和TWF106/pB-IH1ZHA2菌株的L-异亮氨酸产量显著下降，同时细胞外积累了大量的L-苏氨酸，这表明过表达ilvA2未能有效将L-苏氨酸迅速转化为2-OBA，影响了L-异亮氨酸的合成。

图5. 敲除rhtC和livJ基因对大肠杆菌L-异亮氨酸生产效率的改善效果

进一步，研究人员通过敲除rhtC和livJ基因提高大肠杆菌TWF105中L-异亮氨酸生产，其中，rhtC和rhtA是大肠杆菌中编码苏氨酸特异性转运蛋白的主要基因，而livJ基因编码L-异亮氨酸细胞内转运蛋白。研究中发现，敲除rhtC和livJ基因的菌株TWF127/pB-IH1ZHA1展现了最强的生产能力，达到了7.2 g/L的L-异亮氨酸产量，比TWF105/pB-IH1ZHA1高出20%，并且在30小时发酵后只有少量的L-苏氨酸和2-OBA产生。相比之下，敲除rhtC和rhtA的菌株TWF126/pB-IH1ZHA1的L-异亮氨酸产量显著降低，但2-OBA产量增加，这可能是由于rhtC和rhtA的敲除导致细胞内L-苏氨酸积累并转化为2-OBA。这些结果表明，敲除rhtC和livJ可以进一步提高工程化大肠杆菌中L-异亮氨酸的生产效率，同时减少了不必要的前体和副产品的积累。

图6. 利用人工群体感应系统在大肠杆菌中实现L-异亮氨酸自主高效生产的调控机制

研究人员通过人工群体感应(QS)系统在大肠杆菌TWF127中实现L-异亮氨酸的自主高效生产。该系统通过在细胞密度达到特定阈值时激活基因表达，实现了L-异亮氨酸合成关键基因的自我诱导表达。研究中构建了单质粒QS系统（控制器1）和双质粒QS系统（控制器2），均包含luxI和luxR蛋白及其相应的启动子。当细胞密度较低时，系统不会触发QS；而当达到一定密度阈值时，luxR蛋白能够与luxI蛋白产生的酰基高丝氨酸内酯结合，激活QS并诱导luxI启动子控制的基因表达。结果表明，使用QS系统的菌株TWF127/pST1011-IH1ZHA1和TWF127/pST1011, pST1042-IH1ZHA1的L-异亮氨酸产量显著增加，特别是TWF127/pST1011-IH1ZHA1从30 g/L葡萄糖中产生了10.9 g/L的L-异亮氨酸，比TWF127/pB-IH1ZHA1高出51%，并且在发酵过程中基本消耗了L-苏氨酸和2-OBA。这些结果表明，QS系统的应用能够更高效和自主地生产L-异亮氨酸，无需外加诱导剂，为其他生物合成途径的应用提供了新的可能性。

图7. 高产L-异亮氨酸菌株中关键基因的转录水平

接着，研究人员通过实时定量PCR分析了L-异亮氨酸生产菌株TWF127/pST1011-IH1ZHA1和TWF127/pST1011, pST1042-IH1ZHA1中关键基因的表达水平。结果显示，TWF127/pST1011-IH1ZHA1菌株中ilvIH1、ygaZH和CgilvA1基因的转录水平高于TWF127/pST1011, pST1042-IH1ZHA1菌株。这表明在TWF127/pST1011-IH1ZHA1菌株中，这些基因的高表达水平有助于提高L-异亮氨酸的产量，进一步证实了代谢工程策略在增强L-异亮氨酸合成途径中的有效性。

图8. 不同葡萄糖浓度对高产L-异亮氨酸菌株发酵性能的影响

之后，研究人员评估了不同葡萄糖浓度对高产L-异亮氨酸菌株TWF127/pST1011-IH1ZHA1的影响。实验中分别添加了30 g/L、40 g/L和50 g/L的葡萄糖进行发酵，结果表明在40 g/L葡萄糖浓度下，该菌株达到了12.3 g/L的最大L-异亮氨酸产量，产率为0.31 g/g葡萄糖。然而，随着葡萄糖浓度的继续增加，菌株的L-异亮氨酸产量显著下降，说明过高的葡萄糖浓度不利于L-异亮氨酸的发酵生产。

图9. 分批发酵过程中工程化大肠杆菌菌株的L-异亮氨酸生产性能

最后，在2-L生物反应器中进行的补料分批发酵过程中，研究人员测试了工程化大肠杆菌菌株TWF127/pST1011-IH1ZHA1的L-异亮氨酸生产性能。在48小时的发酵周期内，该菌株最终达到了38.6 g/L的L-异亮氨酸产量，产率为0.35 g/g葡萄糖，生产率为0.80 g/(L·h)。

图10. 工程化大肠杆菌菌株在补料分批发酵中的L-异亮氨酸生产能力

此外，另一个工程化大肠杆菌菌株TWF127/pST1011, pST1042-IH1ZHA1在补料分批发酵中也展现了卓越的生产能力，最终L-异亮氨酸产量达到了49.3 g/L，生产率为1.03 g/(L·h)。这一产量和生产率的显著提升，凸显了通过代谢工程和群体感应系统优化策略在提高微生物生产效率方面的潜力，进一步证实了该策略在工业规模生产L-异亮氨酸中的实用价值。

总之，这项工作通过代谢工程和人工群体感应系统的创新应用，不仅在大肠杆菌中实现了L-异亮氨酸的高效自主生产，而且为其他氨基酸的生产提供了新的思路和方法。该研究突破了传统生产方法的限制，为微生物制造领域带来了新的技术革新，展现了合成生物学在推动可持续生物制造中的巨大潜力。

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