天工所代谢工程改造大肠杆菌高效合成乙酸苄酯

科技   2024-09-05 16:30   上海  

    在全球化的今天,乙酸苄酯以其类似茉莉、栀子和铃兰的香气而备受青睐,广泛应用于香水、化妆品和肥皂香精中。然而,由于天然来源的乙酸苄酯无法满足全球每年约10000吨的需求,化学合成成为了主要的生产方式。化学合成不仅依赖于石油等不可再生资源,还伴随着设备腐蚀、副反应多和环境污染等问题。因此,开发一种可持续、环保的生产方式成为了科学研究的重要课题。

图1. 工程大肠杆菌株从头生物合成乙酸苄酯

    2024年9月3日,来自中国科学院天津工业生物技术研究所刘涛研究员殷华副研究员《Microbial Cell Factories》杂志发表了题为“Metabolic engineering of Escherichia coli for high-level production of benzyl acetate from glucose”的研究论文,该团队通过代谢工程手段改造大肠杆菌,实现了从葡萄糖到乙酸苄酯的高效生物合成。研究团队构建了两条基于辅酶A依赖的β-氧化途径的生物合成路线。在路线I中,通过扩展苯甲酸途径,结合羧酸还原酶和大肠杆菌内源的脱氢酶或醛酮还原酶,成功在大肠杆菌中合成了苯甲醇,再通过酵母来源的醇酰基转移酶ATF1将苯甲醇与乙酰辅酶A缩合,形成乙酸苄酯。在路线II中,研究人员评估了通过植物CoA依赖的β-氧化途径,通过苯酰辅酶A合成苯甲醇和乙酸苄酯的可行性。通过过表达来自梭菌的磷酸转移乙酰酶,进一步提高了大肠杆菌中的乙酸苄酯产量。通过两相提取发酵工艺的优化,最终在摇瓶发酵中,最佳菌株在48小时内产生了3.0 ± 0.2 g/L的乙酸苄酯,副产物肉桂酸苄酯的产量仅为2.89 ± 0.29 mg/L。

图2. 通过路线I或路线II从葡萄糖生物合成乙酸苄酯

    研究人员巧妙地设计了两条生物合成途径,将大肠杆菌转化为乙酸苄酯的生产工厂。在路线I中,首先利用苯丙氨酸解氨酶(RgPAL)将L-苯丙氨酸转化为香豆酸(CA),然后通过酰化酶(ScCCLA294G)将其转化为CA-CoA。接着,通过一系列酶的作用,包括烯醇辅酶A水合酶(PhdE)、3-羟基酰基辅酶A脱氢酶(PhdB)和3-酮酰基辅酶A酮水合酶(PhdC),将CA-CoA转化为苯甲酸(BA)。关键步骤是利用羧酸还原酶(CAR)将BA还原为苯甲醛(BALD),最终通过内源性的醇脱氢酶和醛酮还原酶将BALD转化为苯甲醇(BALC)。在路线II中,研究人员利用植物CoA依赖的β-氧化途径,通过3-酮酰基辅酶A硫酯酶(KAT)将3-酮苯丙酰辅酶A(KPP-CoA)转化为苯酰辅酶A(BA-CoA),再由苯甲醛合成酶(PhBS)将BA-CoA转化为BALD。这两条路线展示了从L-苯丙氨酸到乙酸苄酯的高效转化过程,其中路线I在摇瓶发酵中实现了302.9 ± 28.3 mg/L的BALC产量,而路线II则达到了283.0 ± 24.6 mg/L。

图3. 重组菌株生产乙酸苄酯

    在成功合成苯甲醇(BALC)的基础上,研究人员进一步探索了乙酸苄酯的生物合成,筛选了多种酰基转移酶(AATs),包括来自酿酒酵母的ATF1、经过工程改造的氯霉素乙酰转移酶(CATec3-Y20F)和来自烟草的ANN09798,以期找到最佳的催化酶。通过将这些酰基转移酶基因引入大肠杆菌表达系统,并采用两相原位提取发酵策略,研究人员显著提高了乙酸苄酯的产量。结果显示,含有ATF1的工程菌株EcYZ01在1:10(v/v)十二烷覆盖层的发酵中,乙酸苄酯的总产量达到了1151.8 ± 35.4 mg/L,远高于其他酰基转移酶。此外,通过优化发酵条件,如使用1:1(v/v)的十二烷覆盖层,进一步提高了乙酸苄酯的产量至2460.7 ± 199.6 mg/L。

图4. 增强前体和辅因子供应提高乙酸苄酯产量
   
    为了进一步提升乙酸苄酯的产量,研究人员采取了多种策略来优化发酵过程。首先,通过过表达磷酸转移乙酰酶(CkPta)来增加乙酰辅酶A(Acetyl-CoA)的供应,从而为乙酸苄酯的合成提供更多的前体。这一策略在GAP02菌株中得到了成功应用,使得含有ATF1的重组菌株EcYZ07的乙酸苄酯产量提高至1532.3 ± 31.5 mg/L,比原始菌株EcYZ01增加了约30%。此外,研究人员还探索了不同的有机溶剂对两相原位提取发酵的影响。他们发现,使用1:1(v/v)的橄榄油和十四烷基硫酸钠作为提取剂时,乙酸苄酯的产量分别达到了1407.6 ± 47.0 mg/L和2459.3 ± 179.7 mg/L,其中十四烷基硫酸钠的效果与十二烷相当。

图5. 工程大肠杆菌菌株EcYZ07的发酵时间曲线
  
    为了深入了解两相原位提取发酵过程中细胞生长和代谢产物的动态变化,研究人员对最佳表现菌株EcYZ07进行了时间序列分析。在48小时的发酵过程中,细胞生长稳定在OD600为14-16的范围内,同时乙酸苄酯的产量达到了3.0 ± 0.2 g/L,并在此后的时间内保持稳定。此外,副产物肉桂酸苄酯的产量仅为2.89 ± 0.29 mg/L,表明了合成途径的高度专一性。在代谢物分析中,除了乙酸苄酯外,还检测到了微量的香豆酸(CA)累积,但未检测到苯甲酸(BA)的累积,这进一步证实了工程菌株在乙酸苄酯合成过程中的高效性和选择性。
    总之,这项工作不仅首次在单一菌株中建立了基于CoA依赖β-氧化的乙酸苄酯全合成途径,而且报道了大肠杆菌从葡萄糖合成乙酸苄酯的最高滴度。这一成果不仅为生物合成香料提供了新的策略,也为微生物细胞工厂的构建和可持续化学合成路径的开发提供了宝贵的经验和启示,标志着生物制造技术在绿色化学和可持续生产领域迈出了坚实的一步。

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