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湖南师大代谢工程改造刺糖多胞菌高效合成多杀菌素
科技
2024-11-05 16:38
上海
在全球农业领域,害虫控制一直是一个重要议题。传统化学农药的使用虽然有效,但往往伴随着环境和健康风险。因此,开发新型、环境友好型农药成为了科研人员的重要任务。多杀菌素作为一种由土壤放线菌—刺糖多胞菌(
Saccharopolyspora spinosa
)产生的大环内酯类杀虫剂,因其对环境和哺乳动物友好的特性,被视为一种有前景的害虫控制方法。然而,多杀菌素的生物合成产量低,限制了其在工业生产中的应用。
图1.
组合代谢工程优化β-氧化途径和ACC/PCC途径提高多杀菌素的产量
2024年11月2日,来自
湖南师范大学
生命科学学院的
夏立秋教授
在
《J
ournal of Biotechn
ol
ogy》
杂志发表了题为
“Combinatorial metabolic engineering strategy of precursor pools for the yield improvement of spinosad in
Saccharopolyspora spinosa
”
的研究论文,该团队采取了组合代谢工程策略,通过调节前体池供应来增强刺糖多胞菌中多杀菌素的合成。研究团队首先通过过表达β-氧化途径中的关键基因
fadD
、
fadE
和
fadA1
,以及共表达
fadA1
和
fadE
基因,分别使多杀菌素产量提高了0.36倍、0.89倍、0.75倍和1.25倍。进一步,通过采用了β-氧化途径与ACC/PCC途径的组合工程,通过共表达
fadE
和
pccA
基因,以及
accC
和
fadE
基因,分别使多杀菌素产量增加了1.77倍和1.43倍。当在发酵介质中添加外源性三酰甘油时,仅β-氧化途径的工程就使多杀菌素产量提高了7.13倍,达到427.23 mg/L。而β-氧化途径和ACC/PCC途径的组合工程使多杀菌素产量提高了9.61倍,达到625.17 mg/L。通过进一步优化培养基,多杀菌素的产量甚至可以达到1293.43 mg/L,有力地证明了组合策略在促进多杀菌素高效生物合成中的潜力。
图2.
过表达
fadD
、
fadE
和
fadA1
基因对多杀菌素产量及细胞内代谢物水平的影响
研究人员首先通过过表达
fadD
、
fadE
和
fadA1
基因来提升对刺糖多胞菌中多杀菌素产量。与野生型菌株相比,
fadE
和
fadA1
基因过表达的菌株在指数生长期和静止期的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平显著提高,而
fadD
基因过表达的菌株在静止期的甲基丙二酰辅酶A水平高于野生型。
图3.
共表达
fadE
和
fadA1
基因对多杀菌素产量及细胞内代谢物水平的影响
接下来,研究人员通过共表达
fadE
和
fadA1
基因提升刺糖多胞菌中多杀菌素产量。结果显示,与野生型菌株相比,
fadE
和
fadA1
共表达的菌株在指数生长期和静止期的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平显著增加,而甲基丙二酰辅酶A水平在静止期没有显著差异。此外,该菌株在指数生长期和静止期的ATP水平显著高于野生型,而NADPH水平在指数生长期显著下降,但在静止期没有显著变化。这些数据表明,通过共表达
fadE
和
fadA1
基因,可以有效提高细胞内关键代谢物的水平,从而促进多杀菌素的生物合成,产量提高了1.25倍。
图4.
外源性三酰甘油对
fadE
和
fadA1
共表达菌株中多杀菌素产量的影响
研究人员评估了外源性三酰甘油(TAG)对
fadE
和
fadA1
共表达菌株中多杀菌素产量及其初级代谢的影响。研究发现,添加混合油1(含有花生油和菜籽油)和混合油2(含有芝麻油和花生油)能够显著提高
fadE
和
fadA1
共表达菌株的多杀菌素产量,分别提高了2.19倍和1.85倍。蛋白质组学数据分析显示,混合油1的添加可以调节更多参与初级代谢的蛋白质表达水平,如糖酵解途径中的关键酶表达水平上调,而其他分支途径中的酶表达水平下调,这可能有助于增强糖酵解通量,同时减少中间代谢物流向其他分支途径。
图5.
共表达
fadE
与
accC
、
pccA
和
pccB
基因对多杀菌素产量的影响
进一步,研究人员通过共表达
fadE
与
accC
、
pccA
和
pccB
基因提升刺糖多胞菌中多杀菌素产量。研究发现,与野生型菌株相比,
fadE::accC
、
fadE::pccA
和
fadE::pccB
共表达菌株的多杀菌素产量分别提高了1.77倍、1.43倍和1.38倍,达到了170.46 mg/L、149.54 mg/L和146.46 mg/L。在细胞内代谢物水平方面,
fadE::pccA
和
fadE::accC
菌株在第8天的乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A水平显著高于野生型,同时ATP和NADPH水平也显著增加,表明通过代谢工程策略增强了前体供应和细胞内能量代谢,从而提高了多杀菌素的产量。
图6.
共表达
accC
、
pccA
、
fadE
、
accC
、
pccA
和
fadA1
基因提高多杀菌素产量
研究人员探讨了共表达
accC
和
pccA
基因,以及
fadE
、
accC
、
pccA
和
fadA1
基因对刺糖多胞菌中多杀菌素产量及其细胞内代谢物水平的影响。结果显示,与野生型菌株相比,
accC::pccA
和
fadE::accC::pccA
共表达菌株的多杀菌素产量分别提高了1.25倍和1.03倍,达到了138.46 mg/L和124.92 mg/L。在细胞内代谢物水平方面,这些菌株在第8天的丙二酰辅酶A水平显著增加,而乙酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A水平没有显著变化。此外,这些菌株的ATP水平在第8天也显著高于野生型,但NADPH水平没有显著差异。
图7.
外源性三酰甘油对
fadE::pccA
、
accC::pccA
和
fadA1::fadE::accC::pccA
菌株多杀菌素产量的影响
接着,通过在基本发酵培养基(BFM)中添加外源性三酰甘油(TAG),可以显著提升
fadE::pccA
、
accC::pccA
和
fadA1::fadE::accC::pccA
菌株的多杀菌素产量。具体而言,与未添加油脂的野生型菌株相比,这些工程化菌株在添加混合油1、混合油2、混合油3和混合油4后,多杀菌素产量分别提高了9.61倍、8.88倍、7.83倍和8.34倍,产量分别达到625.17 mg/L、582.26 mg/L、520.17 mg/L和550.55 mg/L。这些结果表明,外源性TAG的添加不仅为微生物提供了额外的碳源,还可能通过提高溶解氧水平,进一步促进了多杀菌素的生物合成。
图8.
在营养丰富的发酵培养基(YHM)中代谢工程改造菌株的多杀菌素产量
研究人员在营养丰富的发酵培养基(YHM)中提升菌株的多杀菌素产量。与基本发酵培养基(BFM)相比,这些工程化菌株在YHM中的多杀菌素产量分别提高了1.12倍、0.73倍、0.8倍、0.52倍和1.37倍,产量分别达到467.86 mg/L、381.8 mg/L、397.25 mg/L、335.45 mg/L和523.05 mg/L。
图9.
不同发酵培养基对
fadA
1::fadE::accC::pccA
菌株多杀菌素产量的影响
最后,研究人员探讨了不同发酵培养基对
fadA1::fadE::acc
C::pccA
菌株多杀菌素产量的影响。研究发现,通过优化组合培养基(BYM),即BFM和YHM的组合,可以进一步提升
fadA1::fadE::accC::pccA
菌株的多杀菌素产量。然而,当在BYM中添加混合油1时,多杀菌素产量反而下降。进一步的实验表明,从BYM中去除CaCO
3
后,添加混合油1可以显著提高多杀菌素产量,达到960.15 mg/L。此外,添加Tween 80可以进一步提高产量至1293.43 mg/L,而添加FeCl3则导致产量下降。这些结果揭示了外源性TAG的添加和发酵培养基的优化对于提高多杀菌素产量的重要性,同时也指出了发酵过程中可能存在的代谢负担和营养平衡问题。
总之,这项工作不仅在提高多杀菌素产量方面取得了显著进展,而且为其他天然产物的生物合成提供了新的策略。通过精确调控微生物的代谢途径和能量流,这项工作展示了代谢工程在提高工业微生物生产效率方面的巨大潜力。随着全球对可持续农业和环保型农药需求的日益增长,这一研究不仅有助于减少化学农药的使用,还为开发新型生物农药提供了科学依据,对于推动绿色农业发展和环境保护具有重要意义。
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