随着全球人口老龄化的加剧，抗衰老研究成为了科学界的热点。烟酰胺单核苷酸（NMN）作为一种具有显著抗衰老活性的分子，其在健康产品开发中的潜力引起了广泛关注。然而，NMN的高效合成一直受限于高昂的成本和复杂的生产工艺。 图1. 酶催化合成NMN的示意图 2024年9月17日，来自南京工业大学生物与制药工程学院的任路静教授在《Molecular Catalysis》杂志发表了题为“Design and tailoring of an artificial DNA scaffolding system for efficient production of nicotinamide mononucleotide”的研究论文，该团队设计了一种人工DNA支架系统，通过多酶级联反应高效合成NMN，为抗衰老产品的开发提供了新的可能性。研究人员通过将大肠杆菌中的多磷酸激酶（PPK）与酿酒酵母的烟酰胺核糖激酶（NRK）相结合，实现了ATP的循环利用，从而提高了NMN的生物合成效率1.22倍。进一步开发了基于锌指蛋白的人工DNA支架，将NRK和PPK在体外组装，有效减少了中间代谢物的损失。并通过优化DNA支架的长度，NMN的转化率比单独使用NRK提高了2.37倍。此外，该系统在低浓度ATP条件下表现出更高的NMN合成效率，28 mM ATP时的合成量比42 mM ATP时高出1.13倍。这些数据表明，该DNA支架系统不仅提高了NMN的生产效率，还降低了生产成本，为工业化生产提供了新策略。 图2. 通过NRK和PPK的双重酶耦合催化合成NMN 研究人员首先验证了PPK在ATP再生中的作用，发现在添加PPK后，NMN的产量比未添加PPK的对照组提高了22%。此外，通过调整ATP的初始浓度，研究人员观察到在28 mM ATP条件下，NR的消耗率和NMN的转化率分别达到了95%和86.15%，表明ATP的供应对NMN的生产至关重要。 图3. DNA支架和ATP再生系统的结合 接下来，研究人员通过将锌指蛋白ZFa和ZF268分别融合到NRK和PPK上，成功地在大肠杆菌中表达了这两种融合蛋白，并通过SDS-PAGE验证了它们的表达情况，其中NRK-ZFa和PPK-ZF268的蛋白条带对应分子量分别为63.1 kDa和90.6 kDa。接着，利用电泳迁移率变化分析（EMSA）技术，研究人员证实了融合蛋白能够正确地与人工设计的DNA序列结合。这一结合的验证是实现DNA支架介导的酶组装的关键步骤，通过这种DNA支架系统，研究人员在体外成功地将NRK和PPK共定位，为提高NMN合成效率奠定了基础。 图4. 短链DNA支架对体外NMN合成的影响进一步，研究人员设计了两种短链DNA支架（a2和2a2），并将其整合到双重酶耦合系统中。结果显示，与未添加DNA支架的对照组相比，使用这两种短链DNA支架的反应体系中NMN的产量提高了11%。此外，为了证明DNA支架上酶的结合对于提高NMN产量的重要性，研究人员还设计了两组突变型DNA支架（am和2 m），这些突变型支架因结合位点的人工突变而无法与融合蛋白正确结合。结果显示，使用这些突变型支架的反应体系中NMN的产量并没有提高，从而证实了DNA支架上酶的正确结合是提高NMN产量的关键因素。 图5. 通过延长DNA支架长度增强NMN的生产最后，研究人员通过延长DNA支架长度来增强NMN生物合成效率。实验中设计了三种长链DNA支架（L1、L2和L3），通过调节DNA支架上结合位点的数量和比例，探索了最佳的NMN生产条件。结果显示，在28 mM ATP条件下，使用L1支架的反应体系中NMN的产量达到了对照组的2.37倍，而在42 mM ATP条件下，L1支架仍然能够使NMN产量提高2.03倍。这些结果表明，增加DNA支架上的结合位点数量可以显著提高NMN的产量，这可能归因于更多的酶在支架上的聚集，为底物提供了更多的“靶标”，从而促进了中间产物更直接和完全的转移。此外，相比于短链DNA支架，长链DNA支架L1在提高NMN产量方面表现出了0.92倍的进一步提升。总之，这项研究不仅在分子层面上实现了NMN生产的技术突破，更为生物合成领域提供了一种全新的思路。通过人工DNA支架系统的应用，研究人员能够更经济、更高效地生产生物活性分子，这对于推动健康产业的发展具有重要意义。这项研究的成功预示着未来在生物制药、功能性食品等领域，有望看到更多基于此类技术的创新产品，为人类健康带来更多福祉。
