北化工代谢工程改造大肠杆菌高效合成水杨苷

科技 2024-10-12 16:30 上海

天然植物产物以其结构多样性和显著的生物活性，在药物发现中占据着举足轻重的地位。其中，水杨苷作为一种具有解热镇痛特性的天然糖苷化合物，广泛应用于医药和化妆品行业。然而，水杨苷的传统提取方法不仅步骤繁琐，而且受到季节和地域的限制。此外，化学合成方法不仅产率低、选择性差，而且过程复杂，不利于大规模应用。因此，通过代谢工程手段在微生物中异源表达水杨苷的生物合成途径，成为了一个有吸引力的替代方案。

图1. 代谢工程改造大肠杆菌从葡萄糖生物合成水杨苷

2024年10月9日，来自北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室的申晓林教授和王佳见习教授在《Metabolic Engineering》杂志发表了题为“Engineering a novel pathway for efficient biosynthesis of salicin in Escherichia coli”的研究论文，该团队在大肠杆菌中设计并构建了一条高效的水杨苷生物合成途径。研究团队首先构建了一个非自然的生物合成途径，将莽草酸途径的中间体转化为水杨醇，然后通过筛选和表征，确定了水稻中的OsSGT1酶作为关键的糖基转移酶，该酶能够以UDP-葡萄糖为糖基供体，将水杨醇糖基化形成水杨苷。通过重新定义OsSGT1的最佳底物，并平衡代谢通量，摇瓶发酵中的水杨苷产量达到了4克/升。最终，通过在3升发酵罐中培养高产菌株，实现了14.62克/升的水杨苷合成，这是迄今为止通过微生物发酵实现的最高水杨苷产量。

图2. 代谢工程手段增强莽草酸途径实现水杨醇高效生物合成

研究人员首先构建了含有增强莽草酸途径的质粒pCS-APTA和pZE-EP-CS的菌株ZJ01，并发现该菌株能够产生1042.9 mg/L的水杨醇，比未过表达pCS-APTA的菌株高出3.8倍。进一步的工程化改造，包括敲除PEP消耗相关的基因pykA和pykF，以及阻断苯丙氨酸和酪氨酸合成途径的基因pheA和tyrA，使得菌株ZJ04在摇瓶实验中能够产生高达1773.4 mg/L的水杨醇，与起始菌株相比，产量提升了418%。结果表明，通过精确调控代谢网络和增强前体供应，可以显著提高微生物细胞工厂中目标化合物的产量。

图3. 筛选并鉴定了高效催化水杨醇糖基化的酶OsSGT1

接下来，研究人员测试了不同UDP-糖基转移酶(UGT)对水杨醇糖基化合成水杨苷的催化效率，包括来自拟南芥的UGT74F1、水稻的OsSGT1、狭叶萝摩的UGT73B6^F389S和蛇根木的AS。通过在大肠杆菌BW菌株中分别引入这些UGT基因，并添加2.5 g/L的水杨醇作为底物，研究发现除了OsSGT1外，其他三种UGT对水杨醇几乎没有活性。具体来说，OsSGT1能够将水杨醇转化为水杨苷，产量达到了4.0 g/L，同时还有542 mg/L的水杨醇剩余，这表明OsSGT1对水杨醇具有较高的催化效率。此外，研究人员还评估了OsSGT1对水杨酸的糖基化活性，发现其对水杨酸的转化效率较低，仅产生了3.1 g/L的水杨酸O-β-葡萄糖苷，且有358 mg/L的水杨酸未被消耗。

图4. 通过模块化优化策略调整水杨苷生物合成途径中各模块的表达水平

研究人员将整个途径分解为三个模块：EP模块（表达entC和pchB）、CSO模块（表达Car、Sfp和OsSGT1，将水杨酸转化为水杨苷）和APTA模块（增强莽草酸途径）。通过在不同拷贝数的质粒中表达这些模块，研究人员调整了每个模块的相对表达水平，以优化水杨苷的产量。结果显示，CSO模块对水杨苷产量的影响显著大于EP模块。特别是，CSO模块在中等拷贝数质粒中的表达显著提高了水杨苷产量，表明过高的表达水平并不总是有利的。这些结果还表明，EP模块的过量表达可能会破坏细胞代谢，而CSO模块的低表达水平则无法产生足够的酶来合成中间体。基于模块化优化，菌株ZJ11产生了3.2 g/L的水杨苷，比对照菌株ZJ10提高了191%。这些发现强调了在代谢途径工程中平衡酶表达水平的重要性，以及通过调整不同模块的表达来优化目标化合物产量的潜力。

图5. 通过增强UDP-葡萄糖供应提高水杨苷的生物合成效率

进一步，研究人员通过增强UDP-葡萄糖的供应来提升水杨苷产量。通过在菌株ZJ18中过表达pgm和galU基因，增强了UDP-葡萄糖的生物合成，从而为糖基化反应提供了更多的糖基供体。这一策略有效地将水杨苷的产量提高到了4.0 g/L，相较于未增强UDP-葡萄糖供应的菌株提升了18%。这表明，增加UDP-葡萄糖的供应对于提升水杨苷的生物合成效率具有积极的影响，进一步证实了UDP-葡萄糖作为糖基供体在水杨苷合成过程中的重要性。

图6. 酵母提取物浓度对水杨苷大规模生产的影响

最后，研究人员探讨了不同浓度的酵母提取物对水杨苷大规模生产的影响。通过在发酵过程中添加不同量的酵母提取物，观察到酵母提取物浓度的提高在早期发酵阶段显著增加了细菌的生长量。具体来说，当酵母提取物的浓度从5 g/L增加到15 g/L时，36小时的生物量(OD₆₀₀)从11.50增加到42.82，提高了3.72倍，而60小时时水杨苷的最大滴度也从5 g/L酵母提取物条件下的2.83 g/L增加到了15 g/L条件下的14.62 g/L，提高了5.18倍。然而，当酵母提取物浓度进一步提高到20 g/L时，尽管细胞密度进一步提高，但水杨苷的最大滴度却略有下降。这表明，虽然增加酵母提取物浓度可以促进细胞生长和提高前体物质的积累，但过高的浓度可能导致资源分配不均，从而影响最终的水杨苷产量。这些结果强调了在发酵过程中平衡细胞生长和产物合成的重要性，为优化发酵条件提供了有价值的指导。

总之，这项研究不仅展示了通过代谢工程和合成生物学手段在微生物中合成植物天然产物的潜力，而且为水杨苷的大规模工业生产提供了新的途径。这一成果不仅提高了水杨苷的生产效率和可持续性，还为其他天然产物的生物合成提供了宝贵的经验和策略，有望推动生物制造产业的发展，为未来药物发现和生产提供更多的创新解决方案。

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