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浙工大通过两步底物添加策略在大肠杆菌中高效合成紫檀芪
科技
2024-10-16 16:30
上海
在自然界中,紫檀芪(PST)是一种由某些植物产生的天然抗氧化剂,它作为防御化合物在植物体内以微量形式存在。PST以其抗癌、抗病毒和抗菌等多种健康促进活性而受到关注。然而,由于从植物中提取PST存在挑战,因此开发大规模生物合成PST的方法显得尤为重要。传统的化学合成方法复杂、不可持续,并且可能产生许多有害的副产品。相比之下,利用微生物细胞工厂进行PST的生物合成是一种环保、可持续且成本效益高的替代方案。
图1.
工程化大肠杆菌通过甲基化反应将白藜芦醇转化为紫檀芪
2024年10月14日,来自
浙江工业大学
生物工程学院的
陈小龙教授
在
《Biotechnology and Bioengineering》
杂志发表了题为
“Biosynthesis of pterostilbene in
Escherichia coli
from resveratrol on macroporous adsorption resin using a two-step substrate addition strategy”
的研究论文,该团队通过在大肠杆菌中引入两步底物添加策略,并结合使用大孔吸附树脂(MAR)固定紫檀芪的前体白藜芦醇(RSV),成功增强了PST的生产。研究团队筛选了五种MAR用于RSV的固定,并优化了底物添加策略和发酵参数。实验结果显示,与传统的一步添加游离RSV相比,两步添加策略使PST浓度达到了403 ± 9 mg/L,增加了239%。此外,在3-L生物反应器中,PST产量达到了395 ± 24 mg/L,为PST的经济和工业规模生产提供了一个有前景的途径。
图2.
不同大孔吸附树脂对白藜芦醇和紫檀芪的吸附与解吸特性
研究人员测试了五种不同大孔吸附树脂(MARs)对白藜芦醇(RSV)和紫檀芪(PST)的吸附和解吸特性。通过静态吸附/解吸测试,发现所有吸附剂对PST的吸附和解吸能力都显著高于RSV,这可能归因于PST和RSV的分子结构和极性差异。特别是,XR919C树脂表现出最高的PST吸附率(74.80 ± 6.64%),并且具有较高的RSV吸附率(36.59 ± 3.88%)和解吸率(93.00 ± 0.51%),使其成为进一步过程优化的首选树脂。吸附等温线测试进一步表明,XR919C树脂的吸附能力随着PST和RSV浓度的增加而增加,Langmuir模型的拟合度高于Freundlich模型,表明吸附过程更倾向于单层吸附,且表面上的吸附分子分布均匀。
图3.
不同底物添加策略对紫檀芪产量的影响以及树脂吸附法对提高产量的潜力
接下来,研究人员比较了一步底物添加策略和两步添加策略对紫檀芪(PST)产量的影响。结果显示,当最终RSV浓度在1.75至5.26 mM之间时,两步添加策略比一步添加策略产生了更高的PST产量。特别是在最终RSV浓度为2.63 mM时,两步添加策略得到的PST产量最高,达到了0.72 ± 0.01 mM。此外,通过引入大孔吸附树脂(MAR),研究还考察了不同RSV投喂方法(直接RSV、RSV与MAR共存,或固定化RSV,即IMRSV)对PST产量的影响。结果表明,当使用IMRSV作为底物时,在最终RSV添加量为4.39 mM的条件下,获得了最高的PST产量1.07 ± 0.03 mM,这比其他三种体系在同一RSV浓度下的产量都要高。
图4.
两步底物添加策略中紫檀芪和白藜芦醇在发酵液和树脂中的分布情况
进一步,研究人员深入探讨了在使用RSV与MAR和IMRSV作为底物时,PST和RSV在发酵液和MAR中的分布情况。研究发现,当使用IMRSV时,发酵液中的RSV百分比较低,而MAR中PST的固定化百分比较高,与使用RSV与MAR作为底物相比。具体来说,在两步底物添加策略中,当最终RSV浓度在1.75至5.26 mM之间时,使用IMRSV作为底物的体系在MAR中的PST比例显著高于RSV,这表明IMRSV策略更有效地将前体物质转化为目标产物,并且减少了对有机溶剂的需求,降低了底物毒性,防止了产物抑制对细胞的压力。
图5.
优化发酵条件以提高紫檀芪产量
接着,研究人员对紫檀芪(PST)发酵过程中的参数进行优化。首先,表达诱导温度的实验结果表明,21°C和24°C之间的PST产量没有显著差异,但与其他测试温度相比有显著提高,其中24°C时PST产量达到275 ± 8 mg/L。此外,初次发酵时间的延长从16小时到24小时导致PST产量增加,最优产量在24小时达到峰值,为283 ± 4 mg/L。接种年龄和湿细胞浓度的优化进一步增强了PST的产量,其中14小时的接种年龄和OD
600
为1.2的湿细胞浓度产生了最高的PST产量。此外,添加1.3 g/L的蛋氨酸作为甲基供体,相对于对照组,PST浓度提高了36.17%,达到了353 mg/L。最后,通过添加Triton X-100等表面活性剂,PST产量进一步提升至403 ± 9 mg/L。
图6.
在3升生物反应器中实施两步底物添加策略提升紫檀芪发酵产量
最后,研究人员在3升生物反应器中采用两步底物添加策略生产PST。在发酵16小时后,PST产量达到了182 mg/L,这标志着第一步底物添加的完成,并显著减少了后续发酵的时间。在第二次添加固定化RSV后,随着培养时间的延长,大肠杆菌的生长速率逐渐下降,而PST的产量持续增加。最终,PST的产量达到了395 ± 24 mg/L。这一结果不仅证实了两步底物添加策略在提高PST产量方面的高效性,同时也表明了该策略在减少生产时间和降低成本方面的潜力。
总之,这项工作不仅在实验室规模上实现了PST的高效生物合成,而且为利用可持续的生物制造方法替代传统的化学合成提供了有力的科学依据。通过优化微生物发酵过程和利用大孔吸附树脂技术,该工作为降低PST生产成本、提高生产效率开辟了新途径,这对于推动生物基产品在制药、健康保健和化妆品行业的应用具有重要意义。
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