江南大学代谢工程改造枯草芽孢杆菌从头合成2'-岩藻糖基乳糖

科技 2024-12-20 16:30 上海

在合成生物学的快速发展下，人类对发现新型高价值生物基产品和开发可持续制造技术的兴趣日益增长。人乳寡糖（HMOs）作为母乳中第三大固体成分，对婴儿健康至关重要。其中，2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）是母乳中最重要的HMO之一，对肠道微生物群平衡、神经发育和免疫调节具有显著作用。然而，当前的发酵方案使用多种碳源，增加了生产成本和代谢负担。因此，开发一种能够仅以葡萄糖为唯一碳源从头合成2'-FL的工程菌株，对于降低生产成本和提高生产效率具有重要意义。

图1. 通过代谢工程手段在枯草芽孢杆菌中构建2'-岩藻糖基乳糖从头合成途径

2024年12月17日，来自江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室的刘龙教授在《Metabolic Engineering》杂志发表了题为“De novo 2′-fucosyllactose biosynthesis using glucose as the sole carbon source by multiple engineered Bacillus subtilis”的研究论文，该团队通过多重代谢工程策略改造枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），使得菌株能够仅使用葡萄糖作为唯一碳源来合成2'-岩藻糖基乳糖（2'-FL）。研究中首先通过表达来自脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的β-1,4-半乳糖基转移酶基因，构建了一个乳糖合成模块，并结合乳糖和GDP-L-岩藻糖（GDP-Fuc）生物合成模块，实现了仅以葡萄糖为碳源的2'-FL生产，产量达到2.53 ± 0.07 g/L。进一步通过引入外源非磷酸化转运系统增强了细胞内非磷酸化葡萄糖的供应，使得2'-FL产量提升至4.94 ± 0.35 g/L。研究中还设计了一个转录因子筛选平台，通过改变转录因子LacI的配体特异性，从异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）转变为乳糖，构建了乳糖响应型遗传回路，用于动态调节代谢通量。最终，动态调节菌株在摇瓶中的2'-FL产量提高了107%，达到9.67 ± 0.65 g/L，而在3-L生物反应器中，产量和产率达到30.1 g/L和0.15 g/g。这一成果为未来低成本工业生产2'-FL铺平了道路。

图2. 不同工程菌株在仅以葡萄糖为碳源条件下合成2'-岩藻糖基乳糖的能力

首先，研究人员通过比较两种β-1,4-半乳糖基转移酶（GalT^Nme和GalT^Pmu）在枯草芽孢杆菌中的表达和活性，发现只有来源于脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）的GalT^Nme能够成功合成乳糖，产量为0.44 g/L。接着，通过在BS-1菌株中整合GalT^Nme基因和葡萄糖转运蛋白（Glf），构建了BS-3菌株，该菌株在72小时摇瓶发酵后，2'-FL的产量达到了4.94 ± 0.35 g/L，相较于未整合Glf的BS-2菌株（2.53 ± 0.07 g/L）有了显著提升。此外，通过敲除glcK基因或调节其表达水平，进一步优化了2'-FL的合成效率，其中glcK敲除菌株BS-4的2'-FL产量提升至6.13 g/L，而适度抑制glcK表达的菌株BS-7和BS-8则达到了6.56 ± 0.25 g/L的产量。

图3. 通过基因编辑技术对glcK基因进行敲除和干扰以优化2'-FL合成效率

接下来，研究人员通过CRISPR/Cpf1技术敲除glcK基因，构建了BS-4菌株，与BS-3菌株相比，2'-FL的产量提高了31.3%，达到了6.13 g/L。此外，通过设计针对glcK基因的sgRNA表达盒，构建了BS-6、BS-7和BS-8三个干扰菌株，这些菌株在适度抑制glcK表达时，2'-FL的产量最高，比BS-3菌株高出40.6%，达到了6.56 ± 0.25 g/L。这些结果表明，通过调节glcK基因的表达水平，可以有效地促进2'-FL的合成，为后续构建动态调节基因回路提供了实验依据。

图4. 构建转录因子筛选平台并筛选出能响应乳糖的转录因子突变体的过程

研究人员进一步通过构建转录因子筛选平台以筛选对乳糖响应的转录因子突变体。该平台由转录因子、特定启动子、致死基因hsvTK和荧光蛋白基因sfGFP组成。通过负向筛选，保留了具有DNA结合能力的突变体，这些突变体在5FdU存在时能够抑制hsvTK的转录而存活。正向筛选则是将突变体转移到含有新诱导剂的培养基中，能够响应新诱导剂的突变体会从启动子上解离，激活sfGFP的表达。

图5. 通过流式细胞排序技术筛选出响应乳糖的LacI突变体

接着，研究人员对乳糖响应型LacI突变体进行筛选，通过流式细胞排序技术对目标细菌群体进行了基于荧光信号强度的分类，筛选出了sfGFP、sfGFP+和sfGFP++三个群体。通过对LacI单氨基酸饱和突变体的测试，发现其中四个位点（Ile79、Val150、Ser193和Gln291）的突变体对乳糖有响应活性。特别是I79H、V150A和Q291F三个突变体在1 mM乳糖诱导下，荧光强度相较于对照组有显著增加，最大荧光强度提高了超过7.9倍。这一结果证实了这些突变体能够响应乳糖，为后续构建乳糖响应型遗传回路提供了关键的突变体。

图6. 利用乳糖响应型生物传感器动态调节代谢通量从而增强2'-FL合成

最后，研究人员利用乳糖响应型生物传感器动态调节乳糖和GDP-Fuc生物合成模块以增强2'-FL生产。在动态调节菌株BS-21中，早期由于细胞内乳糖含量低，乳糖生物传感器与P_hy-spank启动子结合，抑制了glcK的表达，导致非磷酸化葡萄糖积累并用于乳糖合成，从而增加了细胞内乳糖浓度。随着乳糖积累，乳糖特异性结合到乳糖生物传感器，使其从启动子上解离，增加了glcK的转录，促进了GDP-Fuc的合成，进而用于2'-FL的合成。与原始菌株BS-3相比，动态调节菌株BS-21在摇瓶发酵中2'-FL的产量提高了107%，达到了9.67 g/L。此外，在3 L生物反应器中，通过控制葡萄糖浓度的补料分批培养策略，BS-21菌株的2'-FL产量和产率分别达到了30.1 g/L和0.15 g/g。这些结果表明，利用乳糖响应型生物传感器进行动态调节可以显著增强2'-FL的合成，为工业规模生产2'-FL提供了有效的策略。

总之，这项工作通过多维度代谢工程策略构建了一种能够高效生产2'-岩藻糖基乳糖的枯草芽孢杆菌菌株，不仅在合成生物学领域取得了突破，而且为其他HMOs的微生物细胞工厂构建提供了宝贵的策略。该研究不仅有助于降低2'-岩藻糖基乳糖的生产成本，提高其在婴儿配方奶粉中的应用可行性，还展示了合成生物学在生物制造领域的巨大潜力，为未来开发更多高价值生物基产品提供了新的思路和方法。

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