中科院微生物所代谢工程改造大肠杆菌高效合成NMN

科技 2024-12-14 16:30 上海

随着全球人口老龄化的加剧，抗衰老和疾病治疗领域的研究越来越受到重视。烟酰胺单核苷酸（NMN）作为NAD⁺的关键前体，已被证实能有效恢复NAD⁺水平，激活与细胞长寿、DNA修复和应激抵抗相关的酶。因此，NMN作为一种有前景的营养补充剂，其高效且经济的生产成为了科研和商业化应用的重要课题。

图1. 大肠杆菌中NMN生物合成途径以及通过基因编辑提高NMN产量

2024年12月10日，来自中国科学院微生物研究所的董志扬研究员联合深圳中科欣扬生物科技有限公司张岩峰在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》杂志发表了题为“High-Level Production of Nicotinamide Mononucleotide by Engineered Escherichia Coli”的研究论文，该团队通过代谢工程手段，在大肠杆菌BW25113中构建了NMN合成途径，从而高效生产NMN。研究团队首先敲除了竞争途径基因，并引入了三个异源基因，编码关键酶烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）、磷酸核糖焦磷酸合成酶和NMN转运蛋白。之后，通过筛选高活性NAMPT和优化基因表达，显著提高了NAM向NMN的转化率，在摇瓶中达到了3503.85 mg/L的产量。进一步通过促进葡萄糖和木糖的共利用，更多代谢通量被转移到PRPP生物合成，最终通过全细胞催化实现了15.66 g/L的NMN产量，并在2-L生物反应器中达到了46.66 g/L的产量，这是迄今为止报道的最高NMN产量，展现了NMN可持续工业生产的潜力。

图2. 通过敲除竞争途径基因以及增强NMN转运提高NMN产量

在大肠杆菌NMN生物合成途径中，烟酰胺（NAM）和磷酸核糖焦磷酸（PRPP）作为前体，经过烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的催化作用转变为NMN。研究人员通过基因编辑技术，敲除了可能降解NMN或竞争PRPP的基因，如pncC、nadR、ushA、umpG、umpH和pncA，以增强NMN的产量。这些改造导致摇瓶中NMN的产量达到了160.66 mg/L。此外，为了提高NMN的外排效率，研究人员过表达了NMN转运蛋白BmPnuC，这一策略使得NMN产量提升至416.67 mg/L，显示了基因编辑在提高微生物代谢产物产量中的关键作用。

图3. 通过对NAMPT酶进行筛选和表达优化提高NMN生物合成效率

接下来，研究人员对16种NAMPT酶进行系统发育分析和基于深度学习模型DLKcat预测kcat值。通过对比这些酶对PRPP和NAM的亲和力，研究人员筛选出了来自Vibrio nigripulchritudo的VniNampt，它对两者都有着较高的亲和力。这一发现与k_cat值的预测相一致，VniNampt在催化NAM向NMN转化的效率上表现最高，达到了823.07 mg/L。这一结果突出了结合酶的k_cat预测值与其在宿主细胞中表达水平的重要性，因为即使某些酶的k_cat值较低，但由于其在宿主中的高表达水平，也可能获得相似的NMN产量。

图4. 通过优化关键基因表达模式提升NMN产量

研究人员聚焦于关键基因表达模式的优化对NMN产量的影响。研究发现，当VniNampt和BsPrs与BmPnuC共表达时，NMN产量有所增加，尤其是当BmPnuC在单独的高拷贝数质粒上表达时，产量达到了3503.85 mg/L，比工程菌株NMN005-Vni高出325.70%。这一结果表明，提高转运蛋白BmPnuC的质粒拷贝数可以增强基因表达，从而提升NMN的合成能力。然而，BmPnuC的转录水平与NMN产量并不完全相关，暗示了可能需要所有三个基因（VniNampt、BsPrs和BmPnuC）的协调表达，而不仅仅是BmPnuC单独的表达，才能实现NMN产量的最大化。

图5. 通过增强木糖利用来提高PRPP供应并增加NMN产量

研究团队通过扰乱编码葡萄糖特异性PTS酶II组分的ptsG基因，并过表达glk基因（编码葡萄糖激酶），以非PTS途径恢复大肠杆菌对葡萄糖的利用，从而缓解碳代谢物抑制（CCR）并提高葡萄糖和木糖的共利用效率。接着，通过过表达木糖转运蛋白（XylE和XylFGH），构建了工程菌株NMN009和NMN010，增强了木糖的转运效率。在全细胞催化过程中，当以10 g/L木糖为唯一碳源时，NMN010表现出更高的木糖转运效率和NMN合成能力，24小时转化后产生了4.46 g/L的NMN，同时剩余1.09 g/L的木糖。这些结果表明，通过改善木糖代谢通量，可以增加PRPP的供应，从而潜在地提高NMN的产量。

图6. 工程菌株NMN011在不同碳源条件下的NMN合成能力

进一步，研究人员使用工程菌株NMN011进行全细胞催化合成NMN。该菌株在以10 g/L木糖为唯一碳源时，能够完全利用木糖，在24小时后产生了7.27 g/L的NMN，这是迄今为止报道的从木糖和NAM中获得的最高NMN产量。当以20 g/L葡萄糖为唯一碳源时，NMN的产量为12.15 g/L。此外，NMN011还能够同时利用葡萄糖和木糖，消耗了9.73 g/L的葡萄糖和9.9 g/L的木糖，最终获得了15.66 g/L的NMN产量。

图7. 在2-L生物反应器中不同碳源组合对NMN011生产NMN的影响

最后，在2-L生物反应器中，研究人员使用不同碳源组合对NMN011进行高细胞密度发酵。当仅以葡萄糖为碳源时，72小时后NMN的产量达到了26.07 g/L。而当与木糖结合使用时，特别是添加20 g/L木糖时，NMN的产量显著增加，达到了46.66 g/L，这是目前报道的最高NMN产量。

总之，这项工作通过系统代谢工程改造，研究团队成功增强了大肠杆菌的PRPP供应能力，并提高了NMN的产量，这对于降低成本、提高生产效率具有重要意义，为未来工业化生产提供了重要的技术基础和理论支持。这项工作不仅推动了NMN作为一种抗衰老和疾病治疗补充剂的商业化进程，也为生物合成高附加值化合物提供了新的策略和参考，有望在生物医药和健康产业中发挥重要作用。

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