上海交大代谢改造链霉菌高效合成井冈霉烯胺

科技 2024-12-03 16:30 上海

在糖尿病治疗领域，井冈霉烯胺作为一种具有抑制葡萄糖苷酶活性的D-葡萄糖类似物，已成为开发抗糖尿病药物的重要前体。然而，由于井冈霉烯胺分子中多个手性中心的构建挑战，其化学合成方法并不具有商业可行性。目前，井冈霉烯胺的生产依赖于一个复杂的半生物合成方法，涉及两个独立的发酵过程，这一过程不仅控制复杂，而且转化效率和特异性低。

图1. 基于非天然糖氨基酸转氨酶WecE的井冈霉烯胺合成途径

2024年11月28日，来自上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室的冯雁教授和崔莉副研究员在《ACS Sustainable Chemistry & Engineering》杂志发表了题为“Engineering of Aminotransferase for Green Biosynthesis of Glucosidase Inhibitor Valienamine in Streptomyces hygroscopicus 5008”的研究论文，该团队提出了一种在井冈霉素A生产菌株吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus 5008）中通过反向代谢工程旁路途径合成井冈霉烯胺的新方法。研究团队首先通过理性空间位阻利用基础的相互作用修改策略，对大肠杆菌中的糖氨基酸转氨酶（SAT）WecE进行结构和相互作用分析，以及色氨酸空间位阻扫描突变，成功增强了之前获得的WecE突变体（M0）的催化活性。之后识别并迭代了三个新的功能残基，得到了三重突变体M3（K209W/K25N/I322D），其活性比M0提高了近6倍。通过代谢工程策略整合和过表达M3，研究人员在吸水链霉菌菌株中重建了井冈霉烯胺合成途径。结果表明，经过96小时培养后，该菌株产生的井冈霉烯胺达到了2.6 mg/L，几乎是使用M0工程化菌株的5倍。

图2. WecE M0变体中非天然底物井冈霉烯胺的结合口袋过大部分的识别

研究人员首先揭示了WecE M0变体中非天然底物井冈霉烯胺的结合口袋过大部分的特征。通过AlphaFold2构建的M0模型显示，与天然底物dTDP-Glc4O-PMP相比，井冈霉烯胺-PMP在结合时并不需要dTDP结合区域，这一区域对于dTDP-Glc4O-PMP的特异性识别是必需的。结构分析表明，通过增加dTDP结合区域的空间位阻，减少与井冈霉烯胺-PMP的不必要相互作用，可以促使井冈霉烯胺-PMP以更有利于催化的构型结合到酶上。这一策略基于对M0模型与4ZAH结构的比较，以及对外部醛胺中间体的计算预测，其中RMSD值为0.159 Å，显示了对接预测的高精度。

图3. 基于动态模拟预测的氢键相互作用以及在M0的dTDP结合区域增加空间位阻的效果

接下来，研究人员通过对M0模型中dTDP部分周围8Å内的46个残基进行100ns的分子动力学模拟，预测了22个可能形成氢键的残基。通过将这些残基突变为带有大侧链的色氨酸，以减少dTDP结合区域的相互作用，实验结果显示，与M0相比，有15个突变体对井冈霉烯胺的催化活性下降超过50%，而K209W、K25W和I322W三个突变体显示出对井冈霉烯胺催化活性的增强，分别提高了3.4倍、3.3倍和1.3倍。

图4. 通过迭代饱和突变策略对WecE M0变体进行催化活性增强的过程

进一步，研究人员通过迭代饱和突变策略增强WecE M0变体的催化活性。首先在K209位点进行突变，生成了11个变体，其中K209W突变体表现出最高的活性，提升了3.4倍。随后，基于K209W的最佳变体M1，进一步对K25进行饱和突变，最终筛选出K25N作为最佳突变体M2，其活性较M1提高了1.4倍。最后，在M2的基础上，针对I322进行第三轮突变，最终获得了三重突变体M3（K209W/K25N/I322D），其催化活性较M0显著提升了5.6倍。

图5. M3突变体与井冈霉烯胺-PMP结合的结构特征及其增强催化活性的可能机制

研究人员分析了M3变体与井冈霉烯胺-PMP结合的结构特征及其增强催化活性的机制。通过对M0和M3的模型进行比较，发现M3在结合口袋的电荷分布和疏水性方面发生了显著变化，M3的结合口袋表面呈现出更负的电势和更高的疏水性，这可能有助于增强与井冈霉烯胺的相互作用。具体而言，M3中K209的氢键相互作用在突变为色氨酸后转变为疏水相互作用，同时S176残基在M3中与井冈霉烯胺-PMP形成了新的氢键，这些变化有助于优化底物的结合配置，进而提高催化效率。通过动力学参数的分析，M3的k_cat和k_cat/K_M值分别提高了近3倍和2倍，进一步验证了M3在催化反应中的优越性能。

图6. 在工程化菌株中通过整合和过表达M3突变体来构建井冈霉烯胺合成途径

最后，研究人员在工程菌株Streptomyces hygroscopicus 5008中，通过整合和过表达M3突变体来构建井冈霉烯胺合成途径。首先通过替换valC基因获得了Val-M3-I菌株，这一步骤阻断了井冈霉烯酮的下游消耗并允许其积累，同时启动了M3介导的转氨反应。为了进一步提升井冈霉烯胺产量，研究者在Val-M3-I菌株中额外插入了一个由kasOp*启动子激活的m3基因拷贝，得到了Val-M3-II菌株。通过OPA预柱衍生化HPLC分析监测，Val-M3-II菌株在96小时培养后井冈霉烯胺产量达到了2.6 mg/L，比对照组（使用M0的菌株）提高了近5倍。

总之，这项工作不仅展示了一种经济有效的井冈霉烯胺生产策略，而且为改善非天然小底物在过大结合口袋中酶促反应提供了一种通用方法。该研究体现了合成生物学在医药和化工产品生产中的巨大潜力，为实现可持续人工反应和环境友好型绿色化学实践提供了有力工具。同时，研究成果进一步推动了生物制造技术的发展，为未来新药发现和药物合成提供了新的思路和方法。

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