天津科大代谢工程改造解脂耶氏酵母高效合成L-苹果酸

科技 2024-10-26 16:30 上海

在面对化石资源日益枯竭的挑战下，可持续生物合成有机酸引起了科研人员的高度关注。L-苹果酸作为一种重要的四碳二羧酸，在食品、化工和制药等行业有着广泛的应用。尽管合成生物学和代谢工程已经实现了L-苹果酸的高效微生物生产，但在解脂耶氏酵母中生产L-苹果酸的能力尚未得到充分利用。

图1. 解脂耶氏酵母中L-苹果酸生物合成的代谢途径

2024年10月23日，来自天津科技大学生物工程学院的张翠英教授和于爱群教授在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Engineering Yarrowia lipolytica to Produce l-Malic Acid from Glycerol”的研究论文，该团队通过代谢工程和实验室适应性进化，成功地在解脂耶氏酵母中实现了L-苹果酸的生产。研究团队首先通过在解脂耶氏酵母中过表达内源生物合成基因和异源转运蛋白基因，确定了甘油合成L-苹果酸途径中的瓶颈。接着，通过在乙醛酸循环途径中过表达异柠檬酸裂解酶、苹果酸合成酶和苹果酸脱氢酶，并引入来自粟酒裂殖酵母的苹果酸转运蛋白，显著提升了L-苹果酸的产量，最高达到了27.0 g/L。通过摇瓶培养基的优化，产量进一步提高至37.0 g/L。最后，通过实验室适应性进化，工程菌株Po1g-CEE2+Sp能够在更低的pH值下耐受并积累更多的L-苹果酸（56.0 g/L）。在5 L生物反应器中放大培养时，L-苹果酸的产量达到了112.5 g/L，为大规模可持续生物合成L-苹果酸和其他有机酸铺平了道路。

图2. 解脂耶氏酵母与毕赤酵母在不同pH条件下的生长比较

研究人员首先比较了解脂耶氏酵母与毕赤酵母在不同pH条件下的耐酸性。通过调整YPD培养基的pH值并观察120小时后的菌株生长情况，研究发现解脂耶氏酵母在pH 3.43时仍能良好生长，而毕赤酵母则没有明显生长。进一步在pH 3.07条件下，解脂耶氏酵母在84小时后开始恢复和适应环境，显示出比毕赤酵母更强的耐酸性。

图3. 通过单基因和多基因共表达策略增强L-苹果酸合成代谢途径

研究人员对TCA循环、rTCA路径和乙醛酸循环路径中的关键酶进行了单基因过表达，发现这些干预显著提升了L-苹果酸的产量。特别地，乙醛酸循环路径中的双基因共表达策略，例如ICLC和MSD的组合，实现了最高的L-苹果酸滴度，达到了21.1 g/L。进一步的实验中，通过三基因共表达，尤其是ICLF、MSE和MDHE1的组合，将L-苹果酸的产量提高到了25.2 g/L。

图4. 引入异源苹果酸转运蛋白和优化培养基提高L-苹果酸产量

接下来，研究人员通过引入异源苹果酸转运蛋白SpMAE1来增强解脂耶氏酵母中L-苹果酸的转运能力。首先比较了解脂耶氏酵母内源的四碳二羧酸转运蛋白YlMAE与异源转运蛋白SpMAE1和C4T318的活性，发现这些转运蛋白的引入显著提高了L-苹果酸的产量，其中与SpMAE1共表达的菌株产量最高，达到了27.0 g/L。此外，通过优化摇瓶培养基，如增加碳源甘油的浓度、添加磷酸盐和碳酸钙作为中和剂，进一步提高了L-苹果酸的产量至37.0 g/L。

图5. 适应性实验室进化策略用于提高解脂耶氏酵母耐酸性

进一步，研究人员通过适应性实验室进化（ALE）策略提高解脂耶氏酵母对酸性环境的耐受性。首先确定了工程菌株Po1g-FEE1+Sp和Po1g-CEE2+Sp的初始酸抗pH值，通过添加不同浓度的L-苹果酸调整培养基pH值。实验发现，工程菌株在pH 3.11以下表现出明显的生长抑制，而在这个pH值以上则能存活并适应酸性环境。通过长达100代的连续培养，成功筛选出酸抗性增强的突变菌株Po1g-FEE1+Sp-ALE和Po1g-CEE2+Sp-ALE。这些突变菌株在pH 2.60的环境下相较于原始菌株展现出更好的生长性能，从而证实了ALE策略在提高解脂耶氏酵母耐酸性方面的有效性。

图6. 耐酸突变菌株在不同pH条件下的生长性能及其L-苹果酸产量

研究人员评估了通过ALE策略获得的耐酸突变菌株Po1g-FEE1+Sp-ALE和Po1g-CEE2+Sp-ALE在不同pH条件下的生长情况和L-苹果酸产量。在pH 6.85的条件下，这些耐酸突变菌株与原始菌株相比展现出更高的生物质产量。更为重要的是，在pH 2.60的严酷酸性条件下，耐酸突变菌株相较于未进化的菌株展现出显著的生长优势和L-苹果酸生产能力，产量分别达到48.6 g/L和56.0 g/L。

图7. 耐酸突变菌株在5 L生物反应器中进行L-苹果酸生产的发酵过程

最后，研究人员使用耐酸突变菌株Po1g-CEE2+Sp-ALE在5 L生物反应器中进行L-苹果酸生产。在不控制pH的情况下，该菌株展现出了极其迅速的生长能力，生物质快速积累，并且在发酵过程中pH持续下降，最终稳定在2.38。在这种酸性环境下，该菌株最终实现了高达112.5 g/L的L-苹果酸产量，对应于每小时0.78 g/L的生产率。此外，发酵过程中甘油的消耗与L-苹果酸的产量之间呈现出1 g甘油转化为0.57 g L-苹果酸的转换率。

总之，这项工作不仅在解脂耶氏酵母中实现了L-苹果酸的高效生产，而且通过创新的代谢工程和实验室适应性进化策略，显著提高了生产效率和菌株的酸耐受性。这一突破不仅为L-苹果酸的工业生产提供了一种新的生物制造途径，也为其他有机酸的可持续生产提供了重要的理论和实践基础。通过减少对化石资源的依赖，这一研究为实现绿色化学和生物经济的可持续发展目标做出了重要贡献。

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