江西师大代谢工程改造钝齿棒杆菌高效合成L-酪氨酸

科技   2024-10-25 16:30   上海  

    在食品、化妆品和制药等多个行业中,L-酪氨酸(L-Tyr)作为一种重要的芳香族氨基酸,其市场需求近年来不断增长。L-Tyr不仅在神经系统发育、抗抑郁治疗和抗氧化功能中发挥关键作用,还是合成高质量芳香族化合物如白藜芦醇和对香豆酸的重要前体。然而,传统的L-Tyr生产方法,包括化学合成和酶促水解,存在环境污染和成本高昂等问题,因此,开发绿色、经济、高效且稳定的L-Tyr生产方法成为了科研人员的重大挑战。

图1. 通过代谢工程手段增强C. crenatum中L-酪氨酸生物合成途径

    2024年10月22日,来自江西师范大学健康学院和生命科学学院的陈雪岚教授《Microbial Cell Factories》杂志发表了题为“Metabolic engineering of Corynebacterium crenatum for enhanced L-tyrosine production from mannitol and glucose”的研究论文,该团队通过代谢工程手段改造了钝齿棒杆菌(C. crenatum),实现了从甘露醇和葡萄糖高效合成L-酪氨酸。研究中通过消除竞争途径、过表达关键酶基因aroBaroDaroE,以及引入突变的大肠杆菌tyrAfbr基因,显著提高了L-酪氨酸的产量。此外,该团队敲除了mtlR基因,并过表达了mtlDpfkB基因,使C. crenatum能够利用甘露醇生产L-酪氨酸。在摇瓶发酵中,L-酪氨酸产量达到了6.42 g/L,比单独使用葡萄糖提高了16.9%。在补料分批发酵中,L-酪氨酸产量更是提升至34.6 g/L,创下了谷氨酸棒状杆菌报道的最高产量。

图2. 通过调节转运蛋白和积累PEP来提高L-酪氨酸产量

    研究团队通过过表达aroBaroDaroE基因来增强前体DAHP的合成,同时敲除qsuBqsuD基因以阻断竞争途径,确保碳源流向L-酪氨酸的合成。此外,通过敲除tyrP基因和敲除/过表达aroP基因来调节L-酪氨酸的转运,减少其在细胞内的积累对细胞的潜在损害。这些改造显著提升了L-酪氨酸的生产效率,其中,通过过表达aroBaroDaroE,L-酪氨酸产量从CCGT03的2.91 g/L提升至CCGT05的3.11 g/L,而进一步改造如CCGT06通过引入突变的tyrA基因,产量进一步提升至3.86 g/L。
    接下来,研究人员通过调节转运蛋白和积累磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)来增强L-酪氨酸生产。研究中发现,敲除pyk基因(CCGT08)相较于CCGT06,L-酪氨酸产量提升了10.8%,达到了4.28 g/L,尽管其在60小时的OD600值有所下降。而过表达ppsA基因(CCGT07和CCGT09)并未显著改变L-酪氨酸的产量。此外,通过敲除tyrP基因(CCGT10),L-酪氨酸产量比CCGT08提高了13.8%,达到4.86 g/L,且细胞生长也得到了改善。

图3. 不同葡萄糖浓度对C. crenatum CCGT10菌株生长和L-酪氨酸产量的影响

    研究人员发现,在20 g/L的葡萄糖浓度下,细胞生长受到显著抑制,这表明葡萄糖浓度过低无法满足细胞生长和代谢的需求。随着葡萄糖浓度的增加,细胞生长逐渐改善,并在40 g/L以上时趋于稳定,说明此时的碳源供应充足,有利于细胞的增殖。在L-酪氨酸的生产方面,20 g/L葡萄糖浓度下的产量仅为2.9 g/L,而当葡萄糖浓度增至80 g/L时,L-酪氨酸的产量达到最优,为5.49 g/L。这表明适宜的葡萄糖浓度对于提高L-酪氨酸的产量至关重要,因为它直接影响到细胞的代谢活性和碳源的可用性。然而,当葡萄糖浓度超过80 g/L时,由于渗透压的变化,可能会对细胞生长和产物合成产生负面影响,导致产量不再增加。

图4. 甘露醇浓度对工程化C. crenatum CCMT04菌株生长和L-酪氨酸产量的影响
   
    进一步,研究人员利用甘露醇作为单一碳源探究其对C. crenatum CCMT01及其衍生菌株生长和L-酪氨酸产量的影响。CCMT01是通过敲除mtlR基因而获得的甘露醇利用能力,它能在含有40 g/L甘露醇的培养基中正常生长,并在60小时内产生1.39 g/L的L-酪氨酸。进一步通过过表达mtlD基因(CCMT02)和甘露醇转运蛋白mtlTD(CCMT03),发现CCMT02在生长和甘露醇利用方面表现更好,其L-酪氨酸产量也提高到1.56 g/L,比CCMT01高出13.04%。此外,通过使用不同强度的启动子过表达pfkB基因(CCMT04、CCMT05和CCMT06),发现CCMT04在生长和甘露醇利用方面表现最佳,其L-酪氨酸产量达到1.84 g/L。研究还发现,甘露醇浓度对CCMT04的生长和L-酪氨酸产量有显著影响,当甘露醇浓度为80 g/L时,L-酪氨酸产量达到最高,为2.12 g/L。这些结果表明,通过代谢工程改造,可以有效地利用甘露醇这一非食品竞争性碳源来增强L-酪氨酸的生产。

图5. 菌株在不同比例混合碳源条件下的生长和L-酪氨酸生产情况
  
    最后,研究人员探究了C. crenatum CCMT04菌株在不同葡萄糖与甘露醇比例的混合碳源条件下的生长和L-酪氨酸生产情况。研究中发现,当葡萄糖与甘露醇的比例为3:1时,CCMT04的生长最佳,且L-酪氨酸的产量达到6.42 g/L,这一产量高于单一碳源条件下的产量,表明混合碳源策略能有效提高L-酪氨酸的生产效率。此外,通过5 L生物反应器进行的补料分批发酵进一步将L-酪氨酸产量提升至34.6 g/L,这是迄今为止报道的谷氨酸棒状杆菌的最高产量。
    总之,这项工作不仅首次将甘露醇作为碳源用于L-酪氨酸的生物合成,而且突显了通过精细调控碳源比例来优化微生物发酵过程的重要性,为未来工业生产L-酪氨酸提供了有价值的参考。通过利用非食品竞争性的碳源,该研究为可持续生产化学品提供了一个有前景的平台,这对于减轻工业生产对食品资源的压力、推动生物制造的绿色转型具有重要意义,展现了合成生物学在解决全球性挑战中的潜力。

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