江南大学代谢工程改造大肠杆菌高效合成水杨酸

科技 2024-10-28 16:31 上海

在医药领域，水杨酸作为一种关键的医药中间体，被广泛用于阿司匹林和拉米夫定等药物的生产。然而，传统上通过科尔贝－施密特反应（Kolbe-Schmitt Reaction）化学合成水杨酸存在反应条件苛刻、成本高昂以及产生有害副产品等问题，导致环境污染。随着代谢工程和合成生物学工具的发展，微生物生产芳香族化合物受到了极大的关注，其中工程化大肠杆菌生产水杨酸因其绿色可持续的生物合成途径而成为研究热点。然而，关键酶的低催化效率和水杨酸对细胞的固有毒性，对大规模微生物生产构成了重大挑战。

图1. 代谢工程改造大肠杆菌高效合成水杨酸

2024年10月25日，来自江南大学生命科学与健康工程学院和生物工程学院的吴静教授在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Rational and Semirational Approaches for Engineering Salicylate Production in Escherichia coli”的研究论文，该团队通过基因敲除和代谢途径优化等策略提高大肠杆菌生物法合成水杨酸的产量。研究团队首先将水杨酸合酶Irp9引入L-苯丙氨酸高产大肠杆菌中，构建了最短的水杨酸生物合成途径。通过蛋白工程，Irp9的催化效率提高了33.5%。进一步，结合适应性进化和转录组分析，阐明了外排蛋白在水杨酸耐受性中的关键机制，并针对性地改造了这些转运蛋白，最终在摇瓶中实现了3.72 g/L的水杨酸产量，这是目前报道的最高水平。

图2. 通过基因敲除和代谢途径优化提高水杨酸产量的代谢工程策略

研究人员选择了高产L-苯丙氨酸的实验室菌株CH-W作为底盘，利用Irp9酶将合成途径从苯丙氨酸扩展到水杨酸。通过在M9最小培养基中培养，引入水杨酸合酶的菌株CH-W01能够产生5.3 mg/L的水杨酸，而CH-W001菌株的产量仅为3.7 mg/L。为了解决副产物L-苯丙氨酸与水杨酸生物合成之间的碳代谢通量竞争问题，研究人员敲除了CH-W01基因组中的pheA/tyrA基因，编码苯丙氨酸合成途径中的关键酶，从而得到CH-W02菌株。这一改造显著提高了前体物质莽草酸的积累，从13.5 mg/L增加到400.1 mg/L，提升了28.6倍，同时水杨酸浓度也从5.3 mg/L提升到38.0 mg/L，增加了6.2倍。此外，L-苯丙氨酸的积累从8.9 g/L降低到0.31 g/L，有效缓解了碳源竞争问题。

图3. 不同代谢工程策略对水杨酸产量的影响

接下来，通过敲除与L-苯丙氨酸合成竞争的途径，CH-W02菌株的水杨酸浓度显著提高。接着，研究人员通过改变Irp9表达所使用的启动子强度，优化了水杨酸的产量，其中带有Trc强启动子的CH-W07菌株表现最佳，水杨酸浓度达到1.68 g/L。进一步，通过CRISPRa/i系统介导的基因组编辑方法，增强了前体物质磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）的供应，使得CH-W15菌株的水杨酸产量增加到2.08 g/L。此外，通过蛋白工程，Irp9酶的催化效率提高了33.5%，将水杨酸产量提升至2.67 g/L。

图4. 工程菌株在水杨酸胁迫下的生长发育情况

进一步，研究人员揭示了大肠杆菌株CH-W17在发酵过程中生长和水杨酸产量的变化，以及不同浓度水杨酸对细胞活力的影响。研究发现，工程菌株在8小时后生长速度减缓，并在16小时后完全停止生长。通过分析发酵后期的细胞样本，发现CH-W17菌株在48小时发酵后的细胞死亡率达到了45.1%。进一步的研究表明，在0.65 g/L水杨酸浓度下，细胞生长受到显著抑制，而在1.5 g/L水杨酸浓度下培养4小时，细胞死亡率比未受压力状态增加了230%，并且细胞表面出现了明显的破裂。为了应对这一挑战，研究人员采用了结合生物传感器和流式细胞排序（FACS）技术的适应性进化方法，以快速筛选出耐水杨酸的菌株。通过251代的连续筛选，所有四个进化系的菌株都能在含有4.0 g/L水杨酸的M9培养基中生长，12小时内达到OD₆₀₀ = 2.4，而未适应的菌株在48小时内仍无法正常生长。尽管进化后的菌株在摇瓶发酵中并未表现出与CH-WJ01菌株在水杨酸产量上的显著差异，但它们显示出更高的荧光强度和加速的生长，表明适应性进化成功提高了菌株对水杨酸的耐受性。

图5. 适应性进化后菌株中与水杨酸耐受性相关的基因表达变化

通过转录组分析，研究人员发现了1416个显著不同的基因，其中718个基因在四个进化系中共同存在，主要集中在如乙酸酯和二羧酸代谢、脂多糖生物合成、淀粉和蔗糖代谢、氮代谢、生物膜形成、双组分系统、阳离子抗菌肽（CAMP）抗性、核糖体等途径。这些基因与跨膜转运蛋白活性、转录、核糖体的结构组分、核糖体结合、外膜周质空间和脂多糖的生物合成等功能相关。此外，还有747个基因表现出上调差异，其中42个基因的变化倍数在10倍以上，被认为可能与耐受性相关；而669个基因表现出下调差异，其中67个基因的变化倍数在100倍以上或根据文献报告可能与耐受性相关。这些下调基因主要集中在能量代谢、脂肪酸生物合成、转运蛋白和假设蛋白上。这些发现为进一步探索水杨酸耐受性的分子机制提供了重要线索，并为通过逆向代谢工程增强菌株耐受性提供了潜在的靶点。

图6. 通过理性设计增强水杨酸耐受性的目标基因

最后，研究人员通过理性设计增强水杨酸耐受性的目标基因，并验证了这些基因对细胞生长和死亡率的影响。研究人员选择了10个上调表达的基因和10个下调表达的基因进行深入分析，这些基因主要涉及转运蛋白、外排蛋白和转录因子。通过在原始菌株CH-W中过表达这些基因，发现过表达mdtN、mraZ和yhfL的菌株在含0.8 g/L水杨酸的M9培养基中的最大细胞密度分别比对照株增加了36.1%、18.0%和39.1%，同时细胞死亡率分别下降了32.6%、21.7%和15.8%。相反，过表达cvpA和hokD1的菌株则出现了生长延迟和细胞死亡率增加。此外，通过CRISPRi系统抑制某些基因的表达，也观察到了细胞死亡率的降低。这些结果表明，通过调节与外排蛋白和膜转运蛋白相关的基因，可以有效提高菌株对水杨酸的耐受性，进而提高水杨酸的生物合成产量。最终，通过组合表达优化，构建了三重组合表达菌株CH-W24，该菌株在摇瓶发酵中能够产生高达3.72 g/L的水杨酸，显著高于对照菌株，证实了这些有益靶点在提高水杨酸耐受性和产量中的潜力。

总之，这项工作不仅在微生物生产水杨酸方面取得了显著进展，而且通过外排蛋白的功能研究，为提高细胞对有毒化合物的耐受性提供了新的策略。这一发现不仅对水杨酸的生产具有重要意义，也可能对其他微生物合成途径的优化和生产效率的提升产生深远影响，推动了可持续生物制造技术的发展，并为未来绿色化学和生物技术领域的研究开辟了新的道路。

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