天津大学代谢工程改造酵母高效合成麦角酸

科技 2024-09-11 16:30 上海

麦角酸（LA）是一系列具有重要药用价值的麦角生物碱的基本前体，广泛应用于治疗神经性疾病和精神疾病。传统上，LA的获取依赖于麦角菌属真菌，这些真菌不仅对农作物构成威胁，而且在提取过程中使用有毒化学物质和高能耗，对环境和人类健康构成风险。因此，开发一种绿色、可持续的LA生产方法具有重要意义。

图1. 利用工程化酵母细胞工厂绿色高效合成LA

2024年9月9日，来自天津大学化工学院合成生物学前沿科学中心的元英进院士和王颖副研究员在《Green Chemistry》杂志发表了题为“Highly efficient synthesis of lysergic acid by engineered budding yeast”的研究论文，该团队通过代谢工程策略，成功构建了一种高效的酿酒酵母菌株用于合成LA。研究发现，敲除SCH9基因是提高LA产量的关键因素，该基因的敲除显著增强了过氧化物酶体代谢和细胞翻译能力。通过转录组分析，研究人员设计了针对性的方法来优化两个限速酶EasC和CloA的活性。通过将EasC重新定位到过氧化物酶体并过表达PEX34，显著提高了这些酶的催化活性，使LA产量提高了2.31倍。此外，通过在内质网重新定向细胞色素P450 CloA及其还原酶，提高了电子转移效率，使LA产量提高了36.8%。这些工程策略最终使LA滴度提高了17.4倍，最终工程菌株在50升的补料批式发酵中产生了509.8 mg/L的LA，这是迄今为止异源宿主报道的最高滴度。

图2. 在农霉素生产酵母中通过鉴定cloA构建麦角酸生物合成途径

研究人员首先通过筛选不同的CloA同源酶，确定了来自麦角菌（C. purpurea）的CloA-1具有最佳的催化效率，能够有效地将农霉素（agroclavine）氧化为LA。LC-MS分析显示，在含有CloA-1的工程菌株Sc244中检测到了LA的生成，其产量显著高出对照菌株，表明了CloA-1在LA合成中的关键作用。

图3. SCH9基因敲除宿主细胞中的全局转录分析与筛选

接下来，研究人员深入探讨了SCH9基因敲除对酿酒酵母宿主细胞全局转录的影响，并分析了这些变化如何促进LA的生物合成。转录组分析显示，SCH9敲除导致4339个基因表达差异显著，其中2124个基因上调，2215个基因下调。特别是，与LA合成相关的代谢途径，如三羧酸循环、甲羟戊酸途径、过氧化物酶体脂肪酸β-氧化途径以及硫胺代谢途径，均发生了显著变化。这些代谢途径的调整不仅增强了酵母细胞的应激能力，还为LA合成提供了更有利的代谢环境。此外，研究人员还发现，SCH9基因敲除后，与LA合成途径相关的异源基因表达水平显著提高，进一步证实了SCH9敲除在提高LA产量中的重要作用。

图4. 在ΔSCH9细胞中通过增强过氧化物酶体代谢消除EasC催化瓶颈

进一步，在敲除SCH9基因的酿酒酵母中，研究人员通过增强过氧化物酶体代谢来克服EasC催化瓶颈。研究发现，过氧化物酶体中的脂肪酸β-氧化途径基因在ΔSCH9细胞中显著上调，这可能导致H₂O₂的积累，为EasC催化反应提供氧化剂。实验中，通过将EasC的原始信号肽替换为SKL，成功将EasC重新定位到过氧化物酶体中，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察到EasC与过氧化物酶体标记蛋白PEX5的共定位。此外，通过在ΔSCH9宿主细胞中表达EasC_SKL，与对照菌株相比，LA产量提高了2.2倍，证实了过氧化物酶体环境对EasC催化活性的重要性。进一步地，通过过表达PEX34和FZO1，增强了过氧化物酶体与线粒体之间的相互作用，使得LA产量在ΔSCH9宿主细胞中进一步提高，显示了通过调节亚细胞器间相互作用来优化代谢流的潜力。

图5. 在ΔSCH9细胞中重新配置CloA和CPR之间的空间距离提高LA滴度

在ΔSCH9酵母菌株中，研究人员通过调整细胞色素P450酶CloA与其还原伴侣CPR的空间分布来优化LA生物合成的策略。研究人员发现，SCH9基因敲除导致与蛋白质合成相关的基因表达上调，这为提高CloA的表达水平提供了有利条件。为了提高电子传递效率，研究人员构建了带有KKYL信号肽的CloA和CPR融合蛋白，并在ΔSCH9和对照菌株中进行表达。实验结果显示，与对照菌株相比，带有KKYL信号肽的融合蛋白在ΔSCH9菌株中使LA产量提高了36.8%，表明通过调整P450酶和其还原伴侣在内质网的空间分布可以有效提高催化效率。

图6. 在酿酒酵母中重建LA合成途径

接下来，研究人员对CpCPR的N-末端进行了不同程度截短，以优化其与CloA的融合表达，其中t36CpCPR变体在ΔSCH9菌株中使LA产量提高了75.3%。进一步地，通过将CloA与t36CpCPR构建成融合蛋白，并在C-末端添加KKYL信号肽，实现了对融合蛋白在内质网上的空间分布的优化，从而在ΔSCH9菌株中进一步提高了LA产量，达到了146.2%的提升。

图7. 在50升生物反应器中对菌株Sc592进行补料批式发酵

最后，研究人员在50升生物反应器中使用重组酿酒酵母菌株Sc592进行补料批式发酵生产LA。在发酵初期，以葡萄糖作为碳源，并保持30°C的温度以增加生物量。随着发酵过程的进行，实时调整葡萄糖流速，并在发酵过程中分批添加酵母提取物。当细胞进入静止期后，将碳源切换为乙醇，并将发酵温度降至22°C。在176小时的发酵过程中，LA的滴度达到了509.8 mg/L，这一产量不仅代表了在异源宿主中报道的最高产量，而且与化学合成和麦角菌深层发酵的传统方法相比，本研究中LA生产方法的原子经济性更高，环境影响更小（E因子为1831），为工业生产LA提供了一种绿色、可持续的替代方案。

总之，这项工作通过敲除SCH9基因并优化两个关键酶的活性，研究人员不仅提高了LA的生物合成效率，而且为未来在酿酒酵母中合成其他麦角生物碱提供了新的思路。该研究展示了一种绿色替代当前基于麦角菌的LA合成路线，提供了一种可持续、大规模发酵生产药用麦角生物碱的多功能平台，为合成生物学在绿色化学领域的应用提供了一个强有力的例证。

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