华东理工代谢工程改造大肠杆菌高效合成聚乳酸-羟基丁酸共聚酯

科技 2024-09-24 16:30 上海

随着全球对环境问题的关注日益增加，生物塑料因其可降解性和生物相容性,成为了解决由化石燃料衍生塑料引起的资源和环境挑战的有希望的方案。在生物塑料中，聚羟基烷酸酯（PHAs）是研究和开发的前沿，其中聚乳酸-羟基丁酸共聚酯（P(LA-co-3HB)）因其高分子量和卓越的生物相容性及可降解性而备受关注。P(LA-co-3HB)的性质可以通过改变乳酸分数进行调节，这依赖于乳酸单体的引入以及微生物合成过程中的效率。

图1. 代谢工程改造大肠杆菌高效合成聚乳酸-羟基丁酸共聚酯

2024年9月19日，来自华东理工大学生物工程学院的吴辉教授在《Bioresources and Bioprocessing》杂志发表了题为“Enhancement of lactate fraction in poly(lactate-co-3-hydroxybutyrate) biosynthesized by metabolically engineered E. coli”的研究论文，该团队通过代谢工程手段改造大肠杆菌，成功提高了P(LA-co-3HB)中乳酸的含量分数。研究团队筛选出两种CoA转移酶用于共聚物生物合成，发现cot_Al能使乳酸含量分数提高31.56%，相较常用的改造后的丙酰-CoA转移酶Pct540_Ap有显著提升。此外，利用木糖作为碳源，并阻断乳酸降解途径，进一步将乳酸含量分数提高至30.42 mol%和52.84 mol%。在5L生物反应器中使用木糖进行发酵，工程菌株产生了60.60 wt%的P(46.40 mol% LA-co-3HB)，与烧瓶实验结果相似。这些数据表明，新CoA转移酶的应用对于其他基于乳酸的共聚物的生物合成具有巨大潜力。

图2. MG1655使用不同来源的CoA转移酶和合成酶合成P(LA-co-3HB)

研究人员利用不同来源的CoA转移酶和合成酶生物合成P(LA-co-3HB)。通过在大肠杆菌MG1655中表达这些酶，并以葡萄糖为碳源进行发酵，研究人员观察到只有cot_Al和cot_Bb成功地将乳酸加入到聚合物中。其中，含有cot_Al的菌株产生了69.00 wt%的P(LA-co-3HB)，乳酸摩尔分数为13.88%，而cot_Bb的则为69.35 wt%，乳酸摩尔分数为8.12%。与常用的pct540_Ap相比（产生了69.65 wt%的P(LA-co-3HB)，乳酸摩尔分数为10.55%），cot_Al显示出更好的性能。此外，cot_Al的应用还增加了乳酸的浓度，表明cot_Al的高通量推动了碳流向乳酸，从而产生了含有更高乳酸分数的共聚物。

图3. MG1655-02使用10 g/L葡萄糖或木糖合成P(LA-co-3HB)

研究人员进一步探讨了碳源对P(LA-co-3HB)共聚物乳酸分数的影响。结果显示，与葡萄糖相比，使用木糖作为碳源时，MG1655-02菌株生产的P(LA-co-3HB)中乳酸含量分数显著提高，达到了76.03 wt%的聚合物含有30.42 mol%的乳酸。尽管使用木糖的菌株最终的光学密度低于使用葡萄糖的菌株，这可能与木糖代谢途径较低的能量产出和较高的二氧化碳释放有关，但木糖的利用却使得乳酸含量分数得到了提升。此外，木糖的代谢通过戊糖磷酸途径和更大的三羧酸(TCA)循环通量，可能导致了与葡萄糖不同的NADH和NADPH的产生源比例，这可能是木糖来源的共聚物含有更高乳酸含量分数的原因。

图4. WXJ01-02使用10 g/L葡萄糖或木糖合成P(LA-co-3HB)

接下来，研究人员探究了阻断D-乳酸降解途径对P(LA-co-3HB)中乳酸含量分数的影响。通过敲除大肠杆菌中的dld基因，阻止了D-乳酸转化为丙酮酸的过程，从而积累了更多的乳酸和乳酸CoA，这显著提高了共聚物中的乳酸含量分数。结果显示，WXJ01-02菌株在利用葡萄糖时产生了64.38 wt%的P(32.08 mol% LA-co-3HB)，而利用木糖时，乳酸分数更是提升至59.93 wt% P(52.84 mol% LA-co-3HB)。此外，与葡萄糖相比，木糖作为碳源时，最终的菌体密度虽然偏低，但两种糖类的消耗速率相近，表明敲除dld后，乳酸的积累并未影响碳源的利用。值得注意的是，敲除dld后，乳酸浓度在24小时内达到峰值，显著高于未敲除dld的菌株，这一现象解释了为什么敲除dld能显著提高共聚物中的乳酸分数。

图5. MG1655-02和WXJ01-02在5L生物反应器中使用10 g/L木糖合成P(LA-co-3HB)

最后，研究人员在5L生物反应器中放大培养MG1655-02和WXJ01-02两株工程菌，并使用木糖作为碳源进行发酵。MG1655-02和WXJ01-02最终分别产生了74.14 wt% P(33.73 mol% LA-co-3HB)和60.60 wt% P(46.40 mol% LA-co-3HB)。两株菌的聚合物含量在36小时后达到了稳定水平，表明在此之后木糖没有继续流入共聚物。MG1655-02在72小时内消耗了所有的木糖，而WXJ01-02还剩余28.15 g/L的木糖，但两者的菌体密度相似，说明木糖没有流入菌体。WXJ01-02的乳酸分数随时间增加，但聚合物含量没有显著变化，表明产生的聚合物不是均一的。而MG1655-02在48小时后明显消耗了乳酸，表明存在非严格的碳源利用层次。这些结果表明，生物反应器中的培养条件可以严格控制，以优化乳酸分数和聚合物含量，为工业规模生产高性能P(LA-co-3HB)提供了重要的实验数据和工艺参数。

总之，这项研究通过优化微生物合成路径，可以生产出具有特定性能的生物塑料，从而满足不同行业的需求。不仅展示了通过微生物工程手段提高生物塑料性能的新途径，也为未来生物塑料的商业化生产和应用提供了重要的科学依据。该研究有助于减少对化石燃料的依赖，并促进了可持续材料科学的发展，为环境保护和资源可持续性开辟了新的道路。

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