华南理工代谢工程改造酵母高效合成β-熊果苷

科技 2024-10-03 16:31 上海

在化妆品行业中，β-熊果苷作为一种皮肤美白添加剂，因其对酪氨酸酶的抑制作用而受到全球公认。然而，β-熊果苷在自然界中的丰度较低，且传统的化学合成或植物提取方法成本效益不高，难以满足市场需求。近年来，科学家们一直在探索如何通过代谢工程技术改造微生物，以实现β-熊果苷的高效生物合成。

图1. 在巴斯德毕赤酵母中成功构建了β-熊果苷的生物合成途径

2024年9月30日，来自华南理工大学生物科学与工程学院的韩双艳教授在《Microbial Cell Factories》杂志发表了题为“De novo biosynthesis of β-Arbutin in Komagataella phaffii based on metabolic engineering strategies”的研究论文，该团队通过在巴斯德毕赤酵母中构建β-熊果苷的生物合成途径，实现了从甲醇出发的高效生物合成。研究团队首先建立了一个基础的β-熊果苷生产途径，产量达到了1.58 g/L。随后，通过融合蛋白构建、增强莽草酸途径通量、增加前体物质（PEP、E4P和UDPG）的供应等多样代谢策略，显著提高了β-熊果苷的产量至4.32 g/L。进一步优化摇瓶中的甲醇浓度后，发酵120小时后的β-熊果苷产量达到了6.32 g/L，是初始产量的四倍。在5L发酵罐中进行的补料发酵实验中，工程菌株UA310达到了迄今为止的最高产量，β-熊果苷产量高达128.6 g/L。

图2. UA1-1菌株的发酵过程显示了β-熊果苷的积累与菌株生长的相关性

在对巴斯德毕赤酵母工程菌株发酵期间，研究人员观察到β-熊果苷的产量与菌株的生长呈现出特定的相关性。在120小时的发酵周期内，UA1-1菌株的β-熊果苷产量稳定积累，最终达到了1.57 g/L。同时，菌株的生长曲线显示，在相同的发酵周期内，菌株的OD₆₀₀也呈现出对数生长期后的稳定增长，表明在发酵过程中菌株的健康生长与代谢产物的合成是同步进行的。

图3. 融合表达策略在UA2-1菌株中提高了β-熊果苷的合成效率

接下来，研究人员通过融合蛋白工程技术增强β-熊果苷生物合成途径。通过将MNX1和AS基因通过GGGS连接子融合表达，成功构建了UA2-1菌株，该菌株在72小时的发酵过程中，β-熊果苷的滴度达到了1.88 g/L，相较于未融合的UA1-1菌株提升了19.7%。此外，为了验证中间体对羟基苯甲酸（pHBA）供应的限制性，研究人员在发酵过程中添加了外源pHBA，结果显示UA2-1的β-熊果苷产量进一步提升，表明通过融合表达策略能够有效促进底物通道的建立，从而增强了β-熊果苷的合成效率。

图4. 莽草酸途径的优化在UA3-10菌株中显著增加了β-熊果苷的产量

研究人员进一步对UA2-1菌株进行一系列的遗传改造，包括过表达DHAPS3、CRS和AroM等莽草酸途径的关键酶，成功筛选出了UA3-10菌株，该菌株在120小时的发酵周期内，β-熊果苷的产量达到了4.32 g/L，与UA2-1相比提高了72.1%。这一显著提升证明了莽草酸途径的代谢通量是β-熊果苷合成的关键限制因素。此外，通过调整初始菌株的OD₆₀₀，进一步优化了菌株的生长速率和代谢状态，为β-熊果苷的高产提供了有力的生理基础。

图5. UA3-10菌株中对前体物质供应的代谢改造对β-熊果苷产量有显著影响

通过对UA3-10菌株进行代谢改造，包括增强PEP、E4P和UDPG的供应，研究人员尝试进一步提升β-熊果苷的产量。尽管过表达PEP羧激酶（Pyk）在UA4-3菌株中取得了一定程度的成功，产量提升了22.2%，达到了3.06 g/L，但通过敲除丙酮酸激酶（Prk）或过表达丙酮酸羧化酶（Pyc）的策略并未带来预期的产量提升。此外，尽管过表达转酮酶（Tkt）旨在增加E4P的供应，但实际结果表明β-熊果苷的产量却下降了37.4%，表明在增强代谢前体物供应的同时，需仔细考虑代谢途径的平衡和潜在的代谢负担。

图6. 甲醇浓度的精确控制对巴斯德毕赤酵母合成β-熊果苷的产量有重要影响

接下来，研究人员专注于探究甲醇浓度对巴斯德毕赤酵母发酵过程中β-熊果苷产量的影响。通过系统地调整甲醇浓度，发现2%的甲醇浓度是提高β-熊果苷产量的最佳条件，在此条件下，UA3-10菌株在120小时的发酵周期内达到了6.32 g/L的β-熊果苷产量，相较于1%甲醇浓度下的产量提升了46.3%。这一显著提升强调了在生物合成过程中对碳源和诱导物浓度进行精确控制的重要性。然而，当甲醇浓度超过2%时，细胞的生长和β-熊果苷的产量并没有进一步增加，反而在3%甲醇浓度下出现了急剧下降，这可能是由于甲醇及其代谢产物甲醛对细胞产生了毒性。

图7. PHK途径的引入在UA8-1菌株中并未提高β-熊果苷的产量

研究人员进一步探索了通过异源PHK（磷酸酮醇酶）途径增强E4P供应对β-熊果苷产量的影响。结果表明，尽管在UA8-1菌株中引入PHK途径的初衷是为了增加E4P的供应，以此提高β-熊果苷的产量，但实际上却发现这一策略并未达到预期效果。UA8-1菌株在72小时时β-熊果苷的产量达到了1.25 g/L的峰值，但整体产量却低于未引入PHK途径的对照菌株，表明PHK途径的引入可能干扰了氧化戊糖磷酸途径中NADPH的生成，从而限制了β-熊果苷的合成。

图8. UA3-10菌株在5L发酵罐中的放大培养实现了β-熊果苷的高效合成

最后，研究人员在5L发酵罐中进行UA3-10菌株的放大培养实验。通过精心设计的两阶段发酵策略，即首先利用甘油作为碳源进行细胞快速生长，然后在甲醇诱导阶段进行β-熊果苷的合成，研究团队成功实现了β-熊果苷的高效合成。在132小时的诱导发酵后，β-熊果苷的产量达到了惊人的128.6 g/L，这一产量不仅较初始菌株UA1-1的68.02 g/L有了显著提升，也创下了使用巴斯德毕赤酵母进行β-熊果苷生产的新高。整个168小时的发酵过程中，共消耗了2996.8克甲醇，获得了总计501克的β-熊果苷，表现出0.958 g/L/h的体积生产率。

总之，这项研究不仅推进了基于低成本发酵的β-熊果苷生产，而且确立了巴斯德毕赤酵母作为合成其他芳香族氨基酸代谢产物的有前景的宿主细胞。这项工作展示了利用合成生物学策略显著提高巴斯德毕赤酵母中β-熊果苷产量的潜力，为使用微生物细胞工厂合成功能性产品提供了一个充满希望的途径，对于满足全球对天然、安全和高效化妆品成分的需求具有重要意义。

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