广州中医药大学代谢工程改造酿酒酵母高效合成达玛二烯醇

科技 2024-11-25 16:30 上海

在传统中药领域，人参皂苷因其显著的药理效果而被广泛研究，特别是多烯型人参皂苷，相较于常见的人参皂苷展现出更强的生物活性。然而由于其在人参中含量低，且主要通过一系列加工步骤从人参皂苷转化而来，导致制备成本较高。为了解决这一挑战，研究人员正在探索新的生物合成途径以提高多烯型人参皂苷的产量和降低其生产成本。

图1. 多烯型人参皂苷的合成途径

2024年11月20日，来自广州中医药大学中药学院的刘中秋教授和段礼新研究员在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“De Novo Biosynthesis of a Polyene-Type Ginsenoside Precursor Dammaradienol in Saccharomyces cerevisiae”的研究论文，该团队首次从艾草中鉴定出一种名为AarOSC20433的达玛二烯醇合酶，并通过代谢工程改造酿酒酵母（S. cerevisiae）实现了多烯型人参皂苷前体—达玛二烯醇的异源生物合成。研究中，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre-Loxp酵母同源重组技术以及抑制竞争途径，显著提高了达玛二烯醇的代谢通量。此外，通过补料和批量发酵，最终在2升生物反应器中达玛二烯醇的产量达到了1.037克/升（4.3毫克/升/OD），为构建多烯型人参皂苷细胞工厂奠定了坚实基础。

图2. GC-MS检测AarOSC20433基因转化酵母菌株产物

多烯型稀有人参皂苷的合成途径，包括热转化路径和达玛烯二醇型人参皂苷的生物合成路径。研究人员通过气相色谱-质谱（GC-MS），分析了AarOSC20433基因转化酵母菌株的产物。其中未知产品峰P1在保留时间为16.5分钟时被检测到。通过高密度发酵和核磁共振（NMR）分析纯化产物，确认产品峰P1为达玛-20,24-二烯-3β-醇，这一发现证实了AarOSC20433基因编码的达玛二烯醇合酶能够产生达玛二烯醇。此外，研究人员通过化学物质谱，进一步验证了产物的结构。

图3. AarOSC20433与其它物种的氧化角鲨烯环化酶（OSCs）的序列比对

研究人员构建了AarOSC20433与其他物种的氧化角鲨烯环化酶（OSCs）的系统发育树。结果表明，AarOSC20433与人参属植物中的达玛烯二醇合酶的高度相似性。多序列比对表明，与底物结合相关的保守DCTAE序列，以及具有负电荷的芳香族氨基酸区域QW（QXXXXXW），对于稳定2,3-氧化角鲨烯的环化反应至关重要。此外，研究人员发现AarOSC20433含有这些高度保守的序列，表明其在催化达玛二烯醇合成中的关键作用。

图4. 角鲨烯工程菌株的构建和代谢通量增强对角鲨烯产量的影响

接下来，研究人员通过同源重组技术，在酵母基因组中过表达了包括HMG-CoA还原酶（tHMGR）在内的多个MVA途径上游基因，这一策略显著增强了乙酰辅酶A的代谢通量，提高了IPP和DMAPP的供应，并缓解了上游的限速步骤，从而增强了角鲨烯的产量。工程菌株GQ01和GQ02在摇瓶发酵后的角鲨烯产量分别达到了277.14 ± 16.42 mg/L和334.20 ± 14.40 mg/L，与野生型菌株CEN.PK2-1D相比，产量提高了40倍。此外，通过引入拟南芥的角鲨烯合酶（AtSQS2）、角鲨烯环氧化酶（AtSQE2）和丹参的法呢基二磷酸合酶（SmFPS），构建了角鲨烯产量更高的菌株GQ03，其角鲨烯产量达到了421.58 ± 33.89 mg/L，几乎是野生型菌株的50倍。

图5. 达玛二烯醇工程菌株的构建和发酵结果

研究人员通过将AarOSC20433基因和SynAtSQE2基因整合到菌株GQ03的多拷贝位点，构建了菌株AE2001。然而，AE2001在摇瓶发酵中仅产生了31.58 ± 1.65 mg/L的达玛二烯醇，表明AarOSC20433环化酶的催化效率较低。为了解决这一问题，研究人员对AarOSC20433基因的密码子使用进行了优化，构建了菌株AE2002，其达玛二烯醇产量提高到了59.21 ± 3.36 mg/L，比对照菌株AE2001提高了87%。此外，通过对AarOSC20433的第654个氨基酸进行突变（E654D），显著提高了其催化效率，使得突变菌株的达玛二烯醇产量增加了近70%。

图6. AarOSC20433酶的分子对接和位点特异性突变对其催化效率的影响

进一步，基于AlphaFold2预测的AarOSC20433的3D结构，研究人员识别了位于活性中心的关键氨基酸残基，包括D484、I533、P564、M729和F736。通过对这些残基进行突变，研究团队构建了多个AarOSC20433突变体，并发现其中E654D突变体的产量最高，产量提高了近70%。分子对接结果表明，E654通过与N652和T677形成氢键来稳定酶，而E654D突变体则不形成类似的氢键，这可能降低了AarOSC20433酶的稳定性，同时提高了其活性。此外，通过突变蛋白质表面的氨基酸，如E654D，研究团队成功影响了酶的催化效率或特异性，减少了蛋白质表面熵，并提高了酵母中的表达水平，同时调节了酶的活性中心环境。

图7. 通过调节ERG7基因表达来优化达玛二烯醇代谢通量

研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，替换了酵母内源基因ERG7的启动子，用以调控与细胞生长和三萜类化合物生产之间的平衡。其中，通过将ERG7的启动子替换为葡萄糖转运蛋白的启动子P_HXT1，成功构建了菌株AE2004。与AE2003相比，AE2004的达玛二烯醇产量提高了43%，达到了145.67 ± 8.06 mg/L。

图8. 在2升生物反应器中通过批量补料发酵生产达玛二烯醇

最后，研究人员在2升生物反应器中菌株AE2004批量补料发酵的过程。通过控制葡萄糖供应，避免了乙醇的产生，减少了对酵母细胞的毒性，从而实现了更高的达玛二烯醇产量。在最初的72小时内，以25 g/L的浓度补料葡萄糖以促进细胞快速生长，当细胞密度OD₆₀₀达到188时，逐渐降低葡萄糖浓度。达玛二烯醇在24小时开始积累，最终在168小时达到了1.037 g/L（4.3 mg/L/OD）的产量，细胞密度OD₆₀₀最终达到241。

总之，这项工作不仅为多烯型人参皂苷的生物合成提供了一个高效的细胞工厂平台，而且展示了合成生物学在传统中药现代化和绿色制造中的潜力。通过精确的基因编辑和代谢途径优化，该研究为稀有活性成分的可持续生产提供了新思路，这对于推动中药全球化和现代化具有重要意义。此外，该研究也为其他珍贵天然产物的微生物合成提供了宝贵的经验和策略，有望在未来的生物制药和健康产业中发挥重要作用。

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