江南大学代谢工程改造酵母高效合成烟酰胺单核苷酸

科技 2024-10-14 16:30 上海

在全球老龄化趋势加剧的背景下，烟酰胺单核苷酸（NMN）作为一种关键的生物活性核苷酸，因其在改善肌肉功能、增强体力活动和延缓衰老方面的潜在功效而受到广泛关注。NMN是辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的前体，对治疗代谢疾病具有重要作用。然而，当前NMN的合成方法主要依赖化学合成和微生物发酵，这些方法不仅成本高昂，还可能存在安全问题和环境负担。因此，开发一种安全、经济、环保的NMN合成方法具有重要的科学和社会价值。

图1. 酿酒酵母中NMN生物合成的代谢途径

2024年10月10日，来自江南大学工业生物技术教育部重点实验室的徐国强副教授在《Biochemical Engineering Journal》杂志发表了题为“Whole-cell synthesis of nicotinamide mononucleotide by recombinant Saccharomyces cerevisiae from glucose and nicotinamide”的研究论文，该团队利用重组酿酒酵母实现了从葡萄糖和烟酰胺出发的全细胞合成NMN。研究团队首先筛选了不同来源的烟酰胺磷酸核糖基转移酶（Nampt）基因，并通过定点突变提高了NMN的合成效率。其中，表达源自松树噬几丁质菌的D83N-Nampt突变体的酵母菌内NMN浓度达到了413.4 mg/L，是野生型酶表达酵母的3.7倍。进一步通过过表达Nampt并减弱NMN的进一步代谢，以及增强前体磷酸核糖焦磷酸（PRPP）的供应，使得菌内NMN浓度提升至1.2 g/L，这是目前酿酒酵母从廉价底物合成NMN的最高滴度。

图2. 不同来源的NAMPT酶在酿酒酵母中的表达效果

研究人员首先比较了来自小鼠（M. musculus）、人类（H. sapiens）和松树噬几丁质菌（C. pinensis）的NAMPT在酵母中的表达效果，发现松树噬几丁质菌来源的NAMPT具有最高的NMN合成效率。进一步通过半理性设计，研究人员对Cp-NAMPT进行了定点突变，其中V75F和D83N突变体表现出最佳效果，使得NMN的浓度分别提高至324.6 mg/L和413.4 mg/L，相较于野生型酶的88.0 mg/L，分别提升了4.3倍和3.7倍。此外，研究人员还尝试了将这两个突变结合，但结果显示双点突变的效果并不如单独的D83N突变体。

图3. Cp-NAMPT突变体与底物结合时的氢键变化

接下来，研究人员深入探讨了Cp-NAMPT突变体（特别是D83N）与野生型酶在结构上的差异，以及这些差异如何影响与底物烟酰胺、PRPP和ATP的相互作用。通过分子对接模拟，研究人员发现D83N突变体与底物形成的氢键数量略有增加，且氢键长度略有缩短，这可能有助于提高酶与底物的亲和力。此外，与野生型相比，D83N突变体的活性口袋体积从1744.22 Å³增加到2429.16 Å³，表明突变可能导致活性口袋空间几何结构的变化，从而可能拓宽了底物的结合位点。

图4. 通过敲除NMA1基因和过表达NAMPT酶来增强NMN合成

研究人员通过敲除NMA1基因，该基因编码的酶负责将NMN转化为NAD⁺，从而减弱NMN的进一步代谢。其中，单独敲除NMA1的菌株产生的NMN浓度为7.1 mg/L，而与Cp-NAMPT过表达结合后，NMN浓度显著提高至381.0 mg/L，比对照组高出3.3倍。此外，研究人员还探索了增加野生型和突变型Cp-NAMPT酶的拷贝数对NMN合成的影响。结果显示，增加野生型NAMPT的拷贝数可以进一步促进NMN的合成，产量达到511.5 mg/L，比单一拷贝表达和基因敲除的组合高出34.3%。然而，增加突变型NAMPT的拷贝数却导致了NMN产量的下降。

图5. Cp-NAMPT突变体的活性口袋结构变化

研究人员深入分析了Cp-NAMPT突变体（特别是Cp-V75F和Cp-D83N）与野生型酶相比在活性口袋结构上的变化，以及这些变化如何影响底物结合和催化效率。通过对比野生型和突变体酶与底物NAM、PRPP和ATP的结合状态，发现突变体可能通过改变活性口袋的空间几何结构来增强底物结合。具体来说，Cp-V75F突变体将较大的氨基酸侧链Phe引入活性口袋，而Cp-D83N突变体则将Asp替换为Asn，这些变化可能扩大了底物的结合口袋。此外，通过分子对接模拟显示，与野生型酶相比，突变体酶与底物D-ribose-5P之间的氢键数量增加，这增强了酶的稳定性，从而可能提高了催化反应的效率。

图6. 全细胞催化系统优化对NMN合成的影响

最后，研究人员研究了全细胞催化系统优化对NMN合成的影响，包括缓冲液类型、细胞处理方式和全细胞催化剂的添加。研究发现，使用Tris-HCl缓冲液代替磷酸钾缓冲液可以提高NMN的合成，使NMN浓度达到855.2 mg/L，比对照组高出9.2%。此外，通过用Triton X-100处理细胞，可以进一步提高NMN的合成，使NMN浓度达到939.1 mg/L，比对照组高出20.9%。最后，通过优化全细胞催化剂的添加量，当添加量为20 OD₆₀₀/mL时，NMN的浓度可以达到1.2 g/L，这是通过优化全细胞催化系统实现的NMN合成的最高水平。这些结果表明，通过细致地调整和优化全细胞催化系统，可以显著提高NMN的合成效率，为工业生物合成提供了有价值的策略。

总之，这一研究不仅在合成生物学领域具有里程碑意义，也为健康产业提供了一种新的生物合成方法。这种方法不仅环境友好、安全，而且能显著降低生产成本，有望推动NMN在食品、饲料和医疗保健领域的广泛应用，预计未来将有更多的生物活性分子通过类似方法被高效、经济地合成，为人类健康和可持续发展做出贡献。

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