华东理工代谢工程改造毕赤酵母高效合成烟酰胺单核苷酸

科技 2024-11-11 16:30 上海

在人类和其他哺乳动物体内，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是一种关键的辅酶，参与细胞氧化还原反应、基因表达、DNA修复和能量生成等多种生物过程。随着年龄的增长，NAD+水平的下降与多种生理衰退相关，而β-烟酰胺单核苷酸（NMN）作为NAD+的关键前体，其补充已被证实能够显著改善小鼠的年龄相关生理衰退和线粒体功能障碍，并在临床试验中显示出增强人类骨骼肌葡萄糖代谢的能力。因此，NMN作为一种流行的原料，被广泛用于制药、食品和化妆品添加剂中，开发成本效益高且高效的NMN生物合成工艺具有重要的价值。

图1. 代谢工程策略用于NMN的半生物合成和从头生物合成

2024年11月9日，来自华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室的蔡孟浩副教授在《Microbial Biotechnology》杂志发表了题为“De novo biosynthesis and nicotinamide biotransformation of nicotinamide mononucleotide by engineered yeast cells”的研究论文，该团队建立了两种技术路径，通过工程化酵母细胞在毕赤酵母中高效合成NMN。研究团队通过系统改造酵母宿主，适应NMN的生物合成和积累。在半生物合成路径中，通过表达烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）并共表达NMN转运蛋白，成功将NMN的积累提高至72.1 mg/L。而在从头生物合成路径中，通过重构异源生物合成途径，优化基因表达水平和前体生成，实现了从葡萄糖（36.9 mg/L）和乙醇（57.8 mg/L）高效合成NMN。最终，在生物反应器中通过补料分批模式培养，分别从2克NAM和868克葡萄糖以及160克葡萄糖和557克乙醇中获得了1004.6 mg/L和980.4 mg/L的NMN滴度，为未来NMN生物合成的优化提供了基础。

图2. 通过遗传改造毕赤酵母细胞实现NMN的半生物合成

研究人员设计了两条NMN生物合成路径。第一条路径是半生物合成NMN，通过在细胞培养期间补充NAM来实现；第二条路径是从头生物合成NMN，通过构建异源NMN合成途径来实现。

首先通过遗传改造毕赤酵母细胞，实现NMN半生物合成。研究中引入了来自不同来源的三种Nampt酶，发现来自松茸（Chitinophaga pinensis）的Nampt-CP表达菌株在0.5 g/L NAM补充条件下，96小时后NMN产量最高，达到13.3 mg/L。进一步通过共表达NAM和NMN转运蛋白NiaP和PnuC，尤其是在Nampt-CP表达菌株中额外表达PnuC后，NMN产量提高了9%，达到14.5 mg/L。此外，通过敲除毕赤酵母中NAM和NMN代谢途径的关键基因，如PAS_chr3_0361、PAS_chr2-1_0598、PAS_chr2-2_0359和PAS_chr2-1_0685，显著提高了NMN的产量，其中四基因敲除菌株（CPN4Δ）在96小时后NMN产量达到56.9 mg/L，是未敲除菌株的2.9倍。

图3. 在工程化酵母细胞中构建异源合成途径实现NMN的从头生物合成

接下来，研究人员在工程化酵母细胞中构建异源合成途径来实现NMN的从头生物合成。研究人员选择了Δku70Δ0361Δ0598Δ0359Δ0685菌株作为宿主，该菌株通过敲除四个基因而不影响细胞生长，但增加了内源性NMN的产量。通过引入从分支酸（CHO）到喹啉酸（QA）的异源途径，包括关键基因PhzE、PhzD、DhbX和NbaC的表达，以及毕赤酵母 NadC的过表达以将QA转化为NaMN，和F. tularensis的NMN合酶（FtNadE）以将NaMN转化为NMN，研究人员成功提高了NMN的产量。特别是，通过增加NadE的表达量，NMN的滴度在24小时内达到了31.9 mg/L，比之前提高了70.6%。此外，通过优化前体供应途径，如表达DAHP合酶和反馈不敏感的突变体Aro4^K229L和Aro3^K222L，进一步提高了NMN的产量。最终，通过在高产量菌株中表达Aro3^K222L，NMN的产量达到了36.9 mg/L，这是未修改NMN途径的Δku70菌株的4.9倍。

图4. 在生物反应器中评估半生物合成和从头生物合成NMN的性能

最后，研究人员在3-L生物反应器中通过半生物合成和从头生物合成两种策略生产NMN。对于半生物合成，CPN4Δ-VP菌株在165小时后产生了1004.6 mg/L的NMN，消耗了约1 g/L的NAM和868 g的葡萄糖。而对于从头生物合成，4ΔNNPPD2NPPA菌株在91小时后产生了980.4 mg/L的NMN，消耗了160 g的葡萄糖和557 g的乙醇。在从头生物合成过程中，还合成了120 mg/L的NAM作为主要副产品。这些结果不仅证明了从头生物合成NMN的潜力，而且显示了使用乙醇作为碳源相比葡萄糖的优势，因为乙醇的成本更低，且在生物合成过程中提供了更多的能量。

总之，这项工作不仅在工程酵母细胞工厂中实现了NMN的半生物合成和从头生物合成，而且通过使用低成本的底物和GRAS（一般认为安全）的宿主，为NMN的工业生产提供了新的视角。该研究不仅展示了通过生物工程手段提高NMN产量的潜力，还为利用可再生碳源生产高价值化合物提供了新的策略，这对于推动可持续生物制造和减轻化学合成的环境负担具有重要意义。

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