重庆大学代谢工程改造酵母高效合成L-哌啶酸

科技 2024-09-18 16:30 上海

在食品和制药行业中，L-哌啶酸（L-PA）因其广泛的生物学和药理学特性而日益受到重视。L-PA是一种必需的手性环状非蛋白氨基酸，历史上通过化学合成方法进行商业化生产。然而，化学合成过程中产生的同分异构体混合物无法满足光学纯度的严格要求，且分离这些同分异构体的成本较高。因此，开发一种更高效、可持续的生产方法对于工业规模的L-PA生产至关重要。

图1. 酿酒酵母中L-PA高效生产的模块化工程策略

2024年9月12日，来自重庆大学化学化工学院的王丹教授和胡舸副教授在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for High-Level Production of L-Pipecolic Acid from Glucose”的研究论文，该团队通过代谢工程手段改造了酿酒酵母BY4743菌株，实现了从葡萄糖到L-PA的高效生物合成。研究团队首先构建了一个优化的生物合成途径，使得在摇瓶中L-PA的产量达到了0.60 g/L。随后，通过多重代谢工程策略，包括底物-酶亲和性改造、全局转录元件工程改造和Kozak序列优化，成功地将L-PA产量提高了8.6倍，摇瓶培养中的产量达到了5.47 g/L。进一步，在5 L的分批补料发酵罐中放大，实现了74.54 g/L的L-PA浓度。

图2. pH值对不同底盘的生长影响以及底物浓度对S. cerevisiae PA00生产L-PA的影响

研究人员发现，大肠杆菌在中性条件下（pH 7）生长最佳，谷氨酸棒状杆菌在碱性条件下（pH 8）生长最旺盛，而酿酒酵母则偏好酸性环境（pH 6），在该条件下展现出最高的生长密度（OD₆₀₀为5.11）。此外，通过调整葡萄糖浓度，探究了其对L-PA产量的影响。结果显示，当葡萄糖浓度为3 g/L时，L-PA的产量最高，达到了0.62 g/L。然而，当葡萄糖浓度进一步增加至4 g/L和5 g/L时，L-PA的产量反而下降，同时伴随着副产物乙醇的显著增加。这表明，在较高的葡萄糖浓度下，大部分葡萄糖被分流用于乙醇的生产，而非L-PA的合成。相比之下，在1-3 g/L的葡萄糖浓度下，葡萄糖主要被用于L-PA的生物合成，从而实现了更高的L-PA产量。

图3. 2-OG与HCS/HCS^A367S的分子对接示意图

接下来，研究人员利用AutoDock软件对高柠檬酸合酶（HCS）与2-酮戊二酸（2-OG）进行了分子对接，识别了A367、K363、K370、T341和W343为关键残基。通过构建不同的HCS突变体并进行发酵实验，发现A367S突变体表现出了最高的L-PA产量，达到了1.54 g/L，大约是野生型HCS的两倍。进一步的酶动力学分析显示，HCS^A367S变体在2-OG的K_m值为1.16 ± 0.48 mM，K_cat值为6.20 ± 0.62 s−1，K_cat/K_m值为5.34 ± 0.89 mM⁻¹ s⁻¹，显示出比野生型HCS更高的亲和力和催化效率。此外，通过氢键分析和蛋白质口袋的疏水性研究，揭示了A367S突变如何增强HCS与2-OG的结合，从而减少L-赖氨酸的抑制作用，为提高L-PA的生物合成效率提供了分子层面的见解。

图4. 通过不同来源的调控因子spt3和spt15共表达以及Kozak序列优化提高L-PA产量

进一步，研究人员通过共表达不同的转录因子spt3和spt15，探索了其对L-PA产量的影响。结果显示，源自S. cerevisiae S288c的spt3和spt15共表达显著提高了L-PA的产量，达到了3.24 g/L。转录组分析揭示了1,325个差异表达基因，其中797个上调和528个下调，这些基因主要涉及翻译、转录、碳水化合物代谢、核苷酸代谢和氨基酸代谢等关键代谢途径。此外，通过在dpkA基因上游添加不同的Kozak序列，研究了这些序列对DpkA蛋白翻译效率的影响。结果显示，含有Kozak序列K2的菌株表现出最佳的翻译效率，L-PA产量达到了5.47 g/L，而不含Kozak序列的K0组产量最低。

图5. 5L生物反应器中S. cerevisiae PA10的分批补料发酵生产L-PA的过程

最后，研究人员在5-L生物反应器中通过分批补料发酵工艺生产L-PA。在发酵的前18至30小时内，通过调节pH至6.0并适时补充葡萄糖，优化了S. cerevisiae的生长条件，使得生物量显著增加，OD₆₀₀从0.61增至37.49。在36小时时，初始添加的葡萄糖被消耗完毕，随后开始第二轮葡萄糖补充，以维持0.3 g/L的葡萄糖浓度。至84小时，L-PA的浓度达到了最高值74.54 g/L，此时的总葡萄糖消耗量为162.68 g/L，L-PA的最终产量为0.46 g/g葡萄糖。

总之，这项工作通过利用可再生的生物质资源，提供了工业规模生产L-PA的新见解，并展示了可持续和经济上可行的传统化学合成方法的替代方案。该研究标志着在微生物代谢工程领域的一个重要进展，有助于减少对化学合成的依赖，对于推动可持续生物制造和工业生物技术的发展具有重要意义。

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