清华大学代谢工程改造大肠杆菌高效合成(R)-1,3-丁二醇

科技 2024-09-09 16:30 上海

(R)-1,3-丁二醇（(R)-1,3-BDO）是一种重要的化学品，广泛应用于化妆品行业作为溶剂，以及在聚合物工业中作为关键单体。由于其高度还原的特性，从糖类原料生产1 摩尔 (R)-1,3-BDO需要消耗3 摩尔的NAD(P)H，这使得生产过程对还原力有很高的需求。甲醇被视为生产高附加值化学品的非食品原料，因其丰富性、成本效益和高还原性而备受关注。然而，目前从甲醇衍生的化学品种类受限，仍处于概念验证阶段。

图1. 代谢工程改造大肠杆菌利用甲醇和糖类生产(R)-1,3-BDO

2023年12月6日，来自清华大学化学工程系工业生物催化教育部重点实验室的陈振副教授在《Biotechnology Notes》杂志发表了题为“Metabolic engineering of Escherichia coli to utilize methanol as a co-substrate for the production of (R)-1,3-butanediol”的研究论文，该团队通过结合原核生物的甲醇脱氢酶（MDH）和真核生物的二羟基丙酮合酶（DAS），构建了一种混合途径，使得甲醇能够转化为中心代谢产物，同时产生NADH。之后通过路径优化和目标基因的敲除，成功开发了一种大肠杆菌菌株，能够在摇瓶实验中产生5.79 g/L的(R)-1,3-BDO，并在批量发酵中使用甲醇和葡萄糖作为共底物，产生13.71 g/L的(R)-1,3-BDO，产率为0.35 C-mol/C-mol。此外，研究还通过¹³C-甲醇标记分析证实了甲醇作为共底物和NADH供应者的角色，并展示了甲醇与木糖共利用生产(R)-1,3-BDO的可能性，扩大了可持续(R)-1,3-BDO生产的底物范围。

图2. 混合甲醇同化途径的构建与优化

研究人员通过在不同的质粒（pRSFDuet、pTrc99a、pCDFDuet）中表达甲醇脱氢酶（MDH）和二羟基丙酮合酶（DAS）在大肠杆菌中构建混合甲醇同化途径，并评估了这些基因在不同拷贝数下的表达对甲醇同化效率的影响。结果显示，高拷贝数的pRSFDuet-mdh-das质粒（菌株S01）虽然能够显著消耗甲醇，但也干扰了葡萄糖代谢，导致较多的未消耗葡萄糖和较少的甲醇消耗。相比之下，中等拷贝数的pCDFDuet-mdh-das质粒（菌株S03）在消耗相似量的甲醇的同时，没有显著积累副产物，表明其更适合于(R)-1,3-BDO的生产。进一步的摇瓶实验表明，当在含有20 g/L葡萄糖和4.5 g/L甲醇的培养基中培养时，菌株S03能够消耗1.20 ± 0.02 g/L的甲醇，产生7.2 ± 0.0 g/L的丙酮酸，并且有6.0 ± 0.0 g/L的葡萄糖未被消耗，证实了混合甲醇同化途径在提高甲醇利用率和促进中心代谢流动方面的潜力。

图3. 重组菌株在葡萄糖和甲醇共存条件下生产(R)-1,3-BDO

接下来，研究人员探究了重组大肠杆菌菌株S04和S05在含有葡萄糖和甲醇的培养基中生产(R)-1,3-BDO的能力。菌株S04在仅含葡萄糖的培养基中表现出较低的(R)-1,3-BDO产量（1.15 ± 0.02 g/L），这暗示了甲醇同化途径与(R)-1,3-BDO合成途径之间可能存在的代谢冲突。然而，当向培养基中添加4.5 g/L甲醇后，S04的(R)-1,3-BDO产量略有提升至1.30 ± 0.04 g/L，这表明甲醇的共利用对于提升产量是有益的。进一步通过基因敲除frmA和frmB基因构建的菌株S05，在相同条件下能够将(R)-1,3-BDO产量提升至5.41 ± 0.32 g/L，并且在添加甲醇的情况下，产量可以进一步提高至5.79 ± 0.17 g/L，表明通过优化甲醇同化途径和调节中心代谢，可以有效增强大肠杆菌生产高附加值化学品的能力。

图4. 菌株S05中关键代谢物的积累情况

进一步，研究人员通过¹³C标记分析揭示了甲醇在大肠杆菌中心代谢中的整合情况及其对(R)-1,3-BDO生产的影响。使用含¹³C标记甲醇的培养基培养的菌株S05显示出，甲醇被有效地整合进入中心代谢途径，如Xu5P/Ru5P（0.68% ± 0.16%）、G6P（0.65% ± 0.14%）、3-HB（0.19% ± 0.03%）和柠檬酸（0.31% ± 0.35%）的¹³C标记水平所示。尽管这些标记的代谢物主要包含单个¹³C原子（M+1），但它们的存在证实了甲醇通过混合XuMP途径成功转化为甘油醛-3-磷酸（GAP）和其他代谢中间体。此外，尽管未检测到¹³C标记的(R)-1,3-BDO，但3-HB的M+1标记水平（0.66% ± 0.15%）表明甲醇主要促进了3-HB的生成，而非最终产品(R)-1,3-BDO。此外，通过测量NAD(P)H浓度的增加，研究进一步证实了甲醇同化过程中额外的还原力对于提升(R)-1,3-BDO生产效率的重要性。

图5. 菌株S05在生物反应器中的批量发酵

研究人员探究了工程菌株S05在生物反应器中进行批量发酵时，不同甲醇浓度对(R)-1,3-BDO生产的影响。实验设置了四个不同的甲醇浓度（0 g/L, 2 g/L, 4 g/L, 和 10 g/L），以评估甲醇添加对生产过程的优化作用。结果显示，当添加2 g/L和4 g/L甲醇时，(R)-1,3-BDO的产量和产率显著提高，分别达到12.39 g/L和13.71 g/L，产率分别为0.34 C-mol/C-mol和0.35 C-mol/C-mol。这表明适量甲醇的添加可以有效促进(R)-1,3-BDO的合成。然而，当甲醇浓度提高到10 g/L时，(R)-1,3-BDO的产量和产率反而下降，同时伴随着丙酮酸的大量积累，这暗示了过高的甲醇浓度可能对细胞代谢产生毒性作用。

图6. 菌株S05在木糖和甲醇共存条件下生产(R)-1,3-BDO

最后，研究人员使用菌株S05在摇瓶发酵中共利用木糖和甲醇生产(R)-1,3-BDO。在含有15.0 g/L木糖和1.21 g/L甲醇的培养基中，工程菌株能够有效地消耗这些底物，并产生2.35 g/L的(R)-1,3-BDO，产率为0.30 C-mol/C-mol。与仅使用木糖作为单一碳源的对照组相比（产生1.99 g/L的(R)-1,3-BDO，产率为0.24 C-mol/C-mol），甲醇的共利用显著提高了(R)-1,3-BDO的产量和产率。此外，通过¹³C标记分析，研究还发现¹³C-甲醇被高效地整合到关键代谢物中，如Xu5P/Ru5P（5.82% ± 1.84% M+1标记）和G6P（7.01% ± 2.24% M+1标记），这进一步证实了甲醇在中心代谢中的同化作用。同时，细胞内NADP(H)和NAD(H)的浓度分别增加了80%和17%，这表明甲醇同化过程中提供的额外还原力对于提升(R)-1,3-BDO的合成效率具有重要作用。

总之，这项工作通过精心设计的代谢工程策略，成功将大肠杆菌转变为能够高效利用甲醇生产(R)-1,3-BDO的细胞工厂。不仅展示了甲醇作为经济碳源和有效NADH供应者的双重潜力，而且通过合成生物学的手段，为可持续生产高价值化学品提供了新的视角。这不仅为生物制造领域带来了创新的解决方案，也为实现碳中和目标提供了有力的技术支持，是向可持续和环境友好型生物制造迈进的重要一步。

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