浙工大代谢工程改造新金分枝杆菌高效合成双降醇

科技 2024-09-21 16:30 上海

类固醇药物作为治疗多种疾病的有效成分，其合成过程中的效率和副产物生成一直是化学和生物工程领域的挑战。特别是在从植物甾体合成21-羟基-20-甲基孕-4-烯-3-酮（4-HBC，双降醇）的过程中，由于底物溶解度差和副产物形成等问题，传统的微生物转化方法面临诸多挑战。因此，构建一条直接的生物转化途径和高效的底物乳化系统显得尤为迫切。

图1. 新金分枝杆菌中的甾体降解途径

2024年9月19日，来自浙江工业大学生物工程学院的郑裕国院士和柳志强教授团队在《Biotechnology Journal》杂志发表了题为“High-efficiency bioconversion of phytosterol to bisnoralcohol by metabolically engineered Mycobacterium neoaurum in a micro-emulsion system”的研究论文，该团队通过代谢工程手段改造了新金分枝杆菌（Mycobacterium neoaurum），实现了在微乳化系统中植物甾体到双降醇的高效生物转化。研究团队首先鉴定并敲除了新金分枝杆菌中的三个新的3-酮类固醇Δ1-脱氢酶（KstD）和3-酮类固醇9α-羟化酶（KsH）同工酶，成功构建了一个能够完全定向合成4-HBC的菌株。此外，研究团队还开发了一种结合大豆油和羟丙基-β-环糊精的微乳化系统，显著提高了底物的溶解性和生物可用性。在批量发酵中，从50克每升的植物甾体中获得了96.7%的摩尔产率和39.5克每升的4-HBC产量，这一成果展示了工业规模生物合成4-HBC的潜力。

图2. 代谢物和基因组学分析

研究人员分析了在不同营养条件下，副产物1,4-HBC的形成情况，发现添加甘油和葡萄糖抑制了1,4-HBC的合成，而酵母提取物的加入则显著增加了其积累。此外，通过基因组测序，研究团队鉴定了两个新的KstD同源基因（KstD4和KstD5），这些基因与已知的KstD1、KstD2和KstD3相比，显示出较低的氨基酸序列相似性（32%–40%），表明它们可能负责1,4-HBC的积累。

图3. 负责1,4-HBC形成的KstD同源物的鉴定

接下来，研究人员深入分析了新金分枝杆菌中3-酮类固醇Δ1-脱氢酶（KstD）同工酶在1,4-HBC副产物形成中的作用。通过对KstD同工酶进行氨基酸序列比对和功能验证，研究发现KstD4和KstD5虽然在体外表现出较低的催化活性，但在菌体内部对于4-HBC和雄甾二烯（AD）的脱氢反应仍然具有重要影响。通过构建敲除突变株并进行发酵实验，结果显示单独敲除kstD4或kstD5导致1,4-HBC的比例略有下降，而同时敲除这两个基因（Mn-HBC_KD）能够完全消除1,4-HBC的生成，并使4-HBC的产率提高了15%。这一结果证实了KstD4和KstD5在代谢途径中对1,4-HBC积累的关键作用，并且通过代谢工程手段有效阻断了副产物的生成，为提高4-HBC的产率和纯度提供了重要策略。

图4. 消除副产品9-羟基-HBC

进一步，研究人员揭示了3-酮类固醇9α-羟化酶（KsH）同工酶在9-羟基-HBC副产物形成中的作用。通过生物信息学分析，研究团队在新金分枝杆菌基因组中鉴定出一个新的KsH同工酶KsHA3，并推测其可能参与C9-羟基化反应。为了验证这一假设，研究者构建了敲除KsHA3的突变株，并评估了其在4-HBC生物合成中的表现。结果显示，敲除KsHA3后，9-羟基-HBC的积累得到了有效抑制，4-HBC的摩尔产率达到了97.7%，远高于之前报道的47%-49%。这一发现不仅阐明了KsHA3在甾体代谢途径中的功能，而且通过定向敲除策略，成功消除了另一个主要副产物9-羟基-HBC的生成。

图5. 筛选与降解甾体相关的启动子库和关键基因

接下来，研究人员通过转录组分析和代谢工程手段增强新金分枝杆菌中4-HBC合成效率。首先通过分析类固醇生物降解相关基因的转录水平，确定了胆固醇氧化酶（ChOx2）和烯醇辅酶A水合酶（EchA19）为限速步骤的关键酶。进一步通过筛选不同的启动子并构建过表达载体，成功实现了这两个基因的高效表达，从而促进了植物甾体向4-HBC的转化。特别是使用K1启动子驱动的chox2和hsp60启动子驱动的echA19的共表达载体，使得4-HBC的产率相比对照组提高了16.2%。

图6. 优化分散技术以促进植物甾体的生物转化

最后，研究人员深入探讨了微乳化系统在提高4-HBC生物合成效率中的作用。通过优化大豆油、羟丙基-β-环糊精（HPCD）和植物甾体的比例，构建了一个高效的微乳化系统，显著提高了底物的溶解度和生物可用性。在5升生物反应器中，通过调整发酵条件和乳化系统，实现了50 g/L植物甾体向39.5 g/L 4-HBC的高效转化，摩尔产率达到了96.7%。特别是在使用大豆油和HPCD构建的油/水双相体系中，通过形成微乳化体系，进一步提高了底物的分散性和细胞的摄取效率。

总之，这项研究不仅在提高双降醇合成效率方面取得了显著进展，而且通过创新的微乳化系统解决了长期困扰生物合成领域的底物溶解度问题。这些发现不仅为类固醇药物的工业生产提供了新的可能性，也为其他难溶性底物的生物转化提供了宝贵的参考。随着生物技术的不断进步，未来有望看到更多高效、环保的生物合成途径被开发出来，进一步推动制药工业的绿色转型和可持续发展。

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