天工所代谢工程改造酵母高效合成苯乙醇苷类化合物

科技 2024-11-29 16:30 上海

在全球对天然产物需求不断增长的背景下，复杂苯乙醇苷类（PhGs）如毛蕊花糖苷（verbascoside）和松果菊苷（echinacoside）因其显著的营养和药理特性而备受关注。然而，传统的植物提取方法产量有限，无法满足工业和药用需求，迫切需要开发新的生产方法。

图1. 工程改造酿酒酵母实现复杂苯乙醇苷类化合物的生物合成

2024年11月26日，来自中国科学院天津工业生物技术研究所的刘涛研究员在《Metabolic Engineering》杂志发表了题为“High-level sustainable production of complex phenylethanoid glycosides from glucose through engineered yeast cell factories”的研究论文，该团队通过工程化酵母细胞工厂，成功实现了从葡萄糖中高效生产复杂PhGs的突破，为绿色、可持续的天然产物生产提供了新途径。研究人员首先筛选出在酵母中具有增强催化活性的关键途径酶，然后通过在酿酒酵母中过表达包括葡萄糖基转移酶RrUGT33、酰基转移酶SiAT和1,3-鼠李糖基转移酶SiRT等酶，成功从葡萄糖生产出中间体桂叶苷，产量达到21.5 ± 1.5 mg/L。进一步通过增加SiAT和AtRHM2基因的拷贝数，并引入芳香醛合成酶PcAAS，将L-酪氨酸转化为酪醇，桂叶苷的产量提高至320.6 ± 59.3 mg/L。通过染色体整合CYP98A20和AtCPR1基因，实现了毛蕊花糖苷的生物合成，产量达到184.7 ± 5.7 mg/L。通过代谢工程进一步增强葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）的表达，毛蕊花糖苷产量显著提高至230.6 ± 11.8 mg/L。最终，通过5L生物反应器的补料发酵，毛蕊花糖苷和松果菊苷的产量分别达到了4497.9 ± 285.2 mg/L和3617.4 ± 117.4 mg/L。

图2. 缓解酵母中AAA生物合成途径瓶颈以合成对香豆酸

首先，研究人员通过遗传改良缓解酵母中AAA生物合成途径中的瓶颈，以合成对香豆酸。研究中，通过一系列的遗传操作，包括引入酪氨酸氨解酶FjTAL和一系列结构基因，使得对香豆酸的产量从最初的22.2 ± 1.1 mg/L逐步提高至最终的325.3 ± 18.4 mg/L。这一过程中，通过表达大肠杆菌中的ARO4K229L、ARO7G141S和EcAROL基因，以及植物中的AtPAL2和AtC4H基因，成功地将L-酪氨酸转化为对香豆酸，为后续的PhGs生物合成提供了关键前体。

图3. 通过增加关键酶基因拷贝数消除桂叶苷生物合成中的限速步骤

接下来，研究人员通过增加关键酶SiAT基因的拷贝数，显著提升了代谢通量，从而增强了桂皮苷A向桂叶苷的转化效率。具体来说，当SiAT基因的拷贝数从1增加到5时，桂叶苷的产量从9.7 ± 1.2 mg/L提升至71.1 ± 2.1 mg/L，显示了3.1倍的增长。这一结果凸显了通过基因拷贝数增加来强化特定代谢途径的有效性，并为进一步提高产量提供了明确的方向。

图4. 通过工程化改造前体酪醇和UDP-L-鼠李糖供应以增强桂皮苷A合成的潜力

研究人员通过增强前体酪醇和UDP-L-鼠李糖的供应来进一步提升桂皮苷A合成的潜力。通过引入芳香醛合成酶PcAAS和增加AtRHM2基因的表达，成功地将更多的代谢流量导向了目标产物。其中，引入PcAAS后，桂皮苷A的产量从210.5 ± 23.5 mg/L提升至320.6 ± 59.3 mg/L，增加了约8.3倍。此外，通过增加AtRHM2基因的拷贝数，进一步提升了UDP-L-鼠李糖的供应，从而促进了桂皮苷A向桂叶苷的转化，桂叶苷的产量达到了320.6 ± 59.3 mg/L。

图5. 在酵母中首次实现从桂叶苷到毛蕊花糖苷和松果菊苷的生物合成

进一步，研究人员通过整合CYP98A20和AtCPR1基因对，成功地将桂叶苷转化为毛蕊花糖苷，产量达到184.7 ± 5.7 mg/L。并通过代谢工程手段，增强了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）的表达，从而提高了NADPH的供应，使得毛蕊花糖苷的产量提升至230.6 ± 11.8 mg/L，增长了24.9%。此外，通过引入FsGT61F144H基因，还成功实现了松果菊苷的生物合成，产量达到184.2 ± 11.2 mg/L。

图6. 在5L生物反应器中通过补料发酵生产毛蕊花糖苷和松果菊苷

最后，研究人员在5L生物反应器中进行补料发酵，显著提高毛蕊花糖苷和松果菊苷的产量。通过维持高细胞密度培养并最小化葡萄糖浓度，毛蕊花糖苷的最终产量达到4497.9 ± 285.2 mg/L，而松果菊苷的产量达到了3617.4 ± 117.4 mg/L。这些结果几乎分别是摇瓶发酵结果的19.6倍和22.4倍，显示了生物反应器在提高细胞工厂生产效率方面的巨大潜力。此外，研究中还观察到超过98.1%的毛蕊花糖苷和91.1%的松果菊苷被分泌到细胞外，这一发现为后续的产品回收和纯化提供了便利，进一步证实了酵母细胞工厂在工业化生产复杂PhGs方面的应用前景。

总之，这项工作不仅在合成生物学和代谢工程领域取得了重要进展，而且为其他复杂PhG衍生物的微生物生产提供了初始点，展示了利用可再生原料通过微生物细胞工厂生产高附加值天然产物的巨大潜力。这项工作不仅为天然产物的可持续生产提供了新的解决方案，也为生物制造和绿色化学工业的发展开辟了新的道路，预示着未来生物技术在医药、食品和化妆品等行业中更加广泛的应用前景。

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