江南大学代谢工程改造大肠杆菌高效合成5′-胞苷酸

科技 2024-12-05 16:30 上海

近年来，随着食品和制药工业的快速发展，对嘌呤核苷酸的需求不断增长，尤其是作为多种核苷酸衍生物关键中间体的5′-胞苷酸（5′-CMP）。传统的5′-CMP生产方法包括核酸水解和化学合成，但这些方法存在反应时间长、分离过程复杂且成本高等问题。因此，开发成本效益高且可规模化的生产过程变得尤为迫切。微生物发酵作为一种具有原料来源广泛、生产效率高、环境友好和可持续性的方法，已成为嘌呤核苷酸生产的研究热点。

图1. 大肠杆菌中5′-CMP生物合成途径的关键基因和代谢路径

2024年12月2日，来自江南大学生物工程学院糖化学与生物技术教育部重点实验室的杨海泉副教授在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》杂志发表了题为“Systematic Metabolic Engineering for Enhanced Cytidine 5′-Monophosphate Production in Escherichia coli”的研究论文，该团队通过系统改造大肠杆菌（Escherichia coli）显著提高了5′-CMP的产量。研究中，通过阻断5′-CMP的降解途径、整合表达5′-CMP二磷酸水解酶基因nudG、增加前体5-磷酸α-D-核糖1-二磷酸（PRPP）的供应等策略，使得工程化大肠杆菌CM006的5′-CMP产量比野生型菌株MG1655增加了134.7倍，达到了417.9 mg/L，这是迄今为止报道的最高值，为5′-CMP的可持续工业生产提供了重要的方法和思路。

图2. 通过基因敲除阻断5′-CMP降解途径以增强其在大肠杆菌中的积累

研究人员通过阻断5′-CMP降解途径来增强其在大肠杆菌中的积累。其中，通过使用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除ppnN基因，构建的工程菌株E. coli CM001的5′-CMP产量达到了20.6 mg/L，比野生型E. coli MG1655提高了20.8倍。进一步地，通过连续敲除ushA、yrfG、yjjG、umpH和umpG基因，5′-CMP的产量在E. coli CM006中增加到了133.4 mg/L，比E. coli CM001提高了13.2%。

图3. 通过过表达关键基因增强大肠杆菌中5′-CMP合成的代谢工程策略

接下来，研究人员通过代谢工程手段在E. coli CM006中过表达nudG、mazG和yhdE基因，显著提升了5′-CMP的产量，其中以nudG基因的过表达效果最为显著，使得5′-CMP产量达到了183.0 mg/L，相比E. coli CM006提高了1.4倍。进一步地，将nudG基因整合到E. coli CM005的基因组中，构建了E. coli CM007，其5′-CMP产量在72小时内增加到了217.7 mg/L，比E. coli CM005提高了1.8倍。

图4. 通过减少尿嘧啶酸积累和减轻反馈抑制提高大肠杆菌5′-CMP产量

研究人员通过减少尿嘧啶酸积累和减轻5′-CMP合成路径中的反馈抑制来增强大肠杆菌中5′-CMP生产。通过整合表达pyrE基因，E. coli CM008在72小时内的5′-CMP产量达到了223.0 mg/L，相比E. coli CM007提高了约22.4%。此外，通过整合表达尿苷激酶突变体基因PyrH(D93A)，E. coli CM009的5′-CMP产量进一步提升至253.0 mg/L，比E. coli CM008增加了13.5%。

图5. 阻断胞嘧啶降解以及增强尿苷-胞嘧啶激酶活性提高大肠杆菌中5′-CMP产量

进一步，研究人员通过阻断胞嘧啶降解途径和整合表达尿苷-胞嘧啶激酶（UCK）基因udk来增强大肠杆菌中5′-CMP生产。首先，通过敲除胞嘧啶脱氨酶基因cdd，阻断了胞嘧啶向尿嘧啶和尿囊酸的降解途径，这一改造使得E. coli CM010的5′-CMP产量在72小时内达到了270.3 mg/L，比E. coli CM009提高了1.1倍。接着，通过在E. coli CM010中整合表达基因udk，进一步增强了从胞嘧啶到5′-CMP的碳代谢通量，使得E. coli CM011的5′-CMP产量增加至338.2 mg/L，比E. coli CM010提高了1.3倍。

图6. 通过增强戊糖磷酸途径的碳代谢通量提升大肠杆菌中5′-CMP产量

最后，研究人员通过增加戊糖磷酸途径（PPP）的碳代谢通量来增强大肠杆菌中5′-CMP生产。通过在E. coli CM011中整合表达核糖磷酸焦磷酸激酶基因prs、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因gnd，增强了PPP途径的碳通量，从而提高了前体5-磷酸-α-D-核糖1-二磷酸（PRPP）的供应，这一改造使得E. coli CM012的5′-CMP产量在72小时内达到了417.9 mg/L，比E. coli MG1655提高了422.1倍。

总之，这项工作不仅在提高5′-CMP产量方面取得了显著成就，而且为微生物细胞工厂的构建提供了新的策略和理论基础。该研究不仅对5′-CMP的绿色工业生产具有重要意义，也为其他相关化学品的微生物生产提供了参考，大大推动了代谢工程在生物制造领域的应用，为实现可持续工业生产和环境保护提供了强有力的技术支持。

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