南理工代谢工程改造解脂耶氏酵母高效合成柠檬酸

科技 2024-12-12 16:31 上海

在全球化的可持续发展和环境保护背景下，柠檬酸作为一种高价值的商业生物产品，在食品、制药、聚合物生产和环境保护等领域有着广泛的应用。然而，传统的柠檬酸生产方式依赖于化学合成或使用黑曲霉发酵，这些方法不仅成本较高，还伴随着环境污染和健康风险。因此，开发一种绿色、可持续的柠檬酸生产方法成为了科学研究的热点。

2024年12月10日，来自南京理工大学环境与生物工程学院的金明杰教授在《Green Chemistry》杂志发表了题为“Efficient production of citric acid from lignocellulose hydrolysate by metabolically engineered Yarrowia lipolytica”的研究论文，该团队通过代谢工程手段改造解脂耶氏酵母（Y. lipolytica），实现了从木质纤维素水解物中高效生产柠檬酸的突破。研究人员首先过表达了与TCA循环相关的基因以增加柠檬酸产量，然后敲除了下游脂肪合成途径中的基因以减少柠檬酸的消耗，同时敲除了异柠檬酸的线粒体转运蛋白以最小化副产物的分泌。此外，研究人员还测试了六个葡萄糖转运蛋白基因、一个己糖激酶基因和一个异源的6-磷酸果糖激酶基因，以增强柠檬酸的生产效率。最终，优化后的工程菌株在纯糖介质中产生了88.2 g/L的柠檬酸，在30%固体负荷的水解液中产生了73.6 g/L的柠檬酸。在3-L生物反应器中，从35%固体负荷的玉米秸秆水解液中生产出了83.6 g/L的柠檬酸。

图1. 通过过表达TCA循环相关基因增强解脂耶氏酵母的柠檬酸合成能力

研究人员首先单独或组合过表达了AMPD、YHM2和ICL基因，以重新定向TCA循环的碳通量向柠檬酸合成，并减少异柠檬酸的形成。结果显示，单独过表达YHM2的菌株BZ-Y产生了最高的柠檬酸积累，达到了62.4 g/L，产率为0.49 g/g。而过表达AMPD的菌株BZ-A产柠檬酸58.6 g/L，产率相似，为0.50 g/g。ICL过表达菌株BZ-I产柠檬酸48.8 g/L，产率为0.48 g/g。进一步的组合过表达实验中，BZ-IY菌株（同时过表达ICL和YHM2）展现了最高的柠檬酸产量70.6 g/L，产率为0.58 g/g。这些结果表明，通过基因过表达可以有效地提高柠檬酸的产量，尤其是YHM2基因的过表达对提高柠檬酸积累起到了关键作用。

图2. 通过敲除脂肪合成关键基因减少柠檬酸的消耗

由于解脂耶氏酵母作为一种产油酵母，其天然的柠檬酸下游代谢途径是脂肪合成，这分散了用于柠檬酸合成的碳资源。研究中，通过敲除ACL、DGA1和DGA2基因，减少了柠檬酸转化为脂肪的消耗。结果显示，敲除DGA1的菌株BZ-IYΔ1表现出了最显著的脂肪积累减少，脂肪含量降至4.8%（wt/wt），并且柠檬酸产率提高到0.75 g/g。而同时敲除DGA1和DGA2的菌株BZ-IYΔ12，其脂肪含量进一步降低到3.98%（wt/wt），柠檬酸产量达到70.5 g/L，产率提高到0.83 g/g，比原始菌株BZ-IY的0.58 g/g提高了37.9%。这些数据证实了通过基因敲除减少柠檬酸在脂肪合成途径中的消耗，可以有效地提高柠檬酸的产量和产率。

图3. 通过敲除异柠檬酸转运蛋白基因ylSFC1减少副产物异柠檬酸的分泌

研究人员发现在BZ-IYΔ12菌株中，异柠檬酸的分泌量为5.5 g/L，而在敲除了ylSFC1基因后的BZ-IYΔ12S菌株中，异柠檬酸的分泌量降低到了2.6 g/L，这证实了敲除ylSFC1基因有效减少了副产物的分泌。尽管如此，主产物柠檬酸的产量从BZ-IYΔ12的70.4 g/L略有下降至BZ-IYΔ12S的64.8 g/L，但柠檬酸产率保持在相似水平，即0.81 g/g对比0.83 g/g。这表明，尽管敲除ylSFC1基因对柠檬酸产量有轻微影响，但对提高产物纯度和简化下游分离纯化过程具有重要意义。

图4. 通过过表达葡萄糖转运蛋白基因Yht3提高菌株对葡萄糖的利用效率

接下来，研究人员通过过表达葡萄糖转运蛋白基因Yht3和己糖激酶基因Hxt1来提高葡萄糖的摄取率。结果显示，过表达Yht3的BZ-IY3Δ12S菌株在120小时内几乎完全消耗了100 g/L的葡萄糖，并在168小时后将剩余的木糖量降低到了12 g/L，柠檬酸产量达到了88.2 g/L，尽管产率略有下降至0.68 g/g。此外，研究人员还尝试过表达了经过密码子优化的改良pfkA基因，以期提高6-磷酸果糖激酶1（PFK1）的活性，但结果表明这并未进一步提升糖消耗率和柠檬酸产量。这可能意味着在解脂耶氏酵母中，PFK1并非柠檬酸合成的限速酶，需要进一步的研究来阐明复杂的代谢途径。因此，BZ-IY3Δ12S菌株因其在提高糖利用效率方面的表现而被选为后续实验的菌株。

图5. 工程菌株在玉米秸秆水解液中展现出高效的柠檬酸生产能力

进一步，研究人员测试了工程化解脂耶氏酵母菌株BZ-IY3Δ12S在不同固体负荷的DLCA(sa)玉米秸秆水解液中发酵生产柠檬酸的能力。在25%固体负荷的水解液中，该菌株能够将68.1 g/L的柠檬酸产量提高到0.50 g/g的产率。当固体负荷增加到30%时，柠檬酸的产量进一步提升至73.6 g/L，产率为0.49 g/g，这表明了菌株对高固体负荷水解液的强适应性和发酵性能。然而，当固体负荷进一步提高到35%时，由于高初始糖浓度和高抑制物含量的影响，菌株在144小时内未能完全消耗葡萄糖，导致柠檬酸产量下降至48.6 g/L。

图6. 通过批式和连续补料发酵策略实现了柠檬酸高效生产

最后，在3-L生物反应器中，研究人员使用30%固体负荷的DLCA(sa)玉米秸秆水解液进行批式和连续补料发酵的过程。在批式发酵中，BZ-IY3Δ12S菌株在120小时内消耗了所有的葡萄糖，并在168小时内消耗了木糖，最终柠檬酸产量达到了74.2 g/L，产率为0.46 g/g。在连续补料发酵中，通过三次补料，最终固体负荷达到35%，尽管随着补料的进行抑制物含量增加导致木糖利用率下降，但在216小时结束发酵时，柠檬酸产量达到了83.6 g/L，产率和生产率分别为0.44 g/g和0.39 g/L/h。这一结果不仅代表了从未经解毒的木质纤维素水解液中柠檬酸产量的最高记录，而且强调了在不添加额外氮源的情况下进行发酵的经济和环境优势，为柠檬酸的可持续生产提供了有力的证据。

总之，这项工作通过使用木质纤维素水解物作为原料，研究团队展示了一种环保且经济的柠檬酸生产方法，这不仅提高了柠檬酸的产量和产率，而且降低了副产物的形成。该研究不仅在实验室层面取得了显著的成果，而且对于推动柠檬酸生产的工业化进程具有重要意义。同时，也为其他有机酸的生物合成提供了宝贵的参考，是绿色化学和可持续生物技术领域的一个重要里程碑。

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