北化工代谢工程改造大肠杆菌高效合成香豆素及衍生物

科技 2024-09-25 16:30 上海

在自然界中，香豆素类化合物以其多样的生物活性和独特的光学性质而闻名，广泛应用于医药、化妆品和光化学工业。然而，传统的香豆素生产依赖于化学合成和植物提取，这些方法不仅成本高昂，还可能对环境造成压力。随着合成生物学的发展，人们开始寻求通过生物合成途径来可持续且经济地生产香豆素。其中，香豆素生物合成的关键步骤和限速步骤是由肉桂酰辅酶A正羟化酶（CCHs）催化的。但是，由于底物体积庞大和结构活性关系不明确，对CCHs的工程化改造一直是一个挑战。

图1. 通过结合蛋白质工程和代谢工程建立大肠杆菌合成香豆素的平台

2024年9月21日，来自北京化工大学化工资源有效利用国家重点实验室的孙新晓教授和袁其朋教授在《Metabolic Engineering》杂志发表了题为“Establishing a coumarin production platform by protein and metabolic engineering”的研究论文，该团队通过结合蛋白质工程和代谢工程，成功构建了一个香豆素生产平台。研究团队首先利用定向进化和结构引导工程，采用基于荧光的筛选方法，对来自拟南芥的CCH（AtF6′H）进行改造，获得的表面突变体和底物特异性口袋突变体显著提高了催化活性，并通过结构分析和分子动力学模拟阐明了导致催化效率提高的机制。之后通过结合优化的上游生物合成途径，三种简单香豆素的滴定量提高了5至22倍，进一步引入的糖基化模块，实现了四种香豆素葡萄糖苷的生产，其中芸香素的滴定量增加了15.7倍，规模化发酵达到了3克/升。

图2. 表面突变体提高酶的性能

研究人员首先通过定向进化来提高AtF6′H对FEC的催化效率。通过易错PCR（epPCR）对AtF6′H进行随机突变，并建立了基于1号化合物（香豆素）的自发荧光特性的体内筛选流程。通过这种方法筛选出了一系列活性增强的突变体，包括D102E/E190K、E163K、L196F、K199N和N311G，其中最佳突变体D1（D102E/E190K）的k_cat/K_m比野生型提高了5倍。此外，这些表面突变体对另一底物CAC的活性与野生型相当，而口袋突变体N311G的活性则有所降低。通过迭代突变方法，研究人员进一步测试了其他三个表面突变体的协同效应，发现组合突变体D5（D102E/E163K/E190K）的k_cat/K_m比野生型提高了8.3倍。

图3. AtF6′H的结构引导工程

接下来，研究人员对AtF6′H进行结构引导工程改造，特别是针对活性口袋周围残基的定向突变，以增强其对FEC底物的催化活性。首先将模型底物FEC对接至AtF6′H的三维结构中，基于2ODG催化羟化反应的共识机制和C6及Fe(II)的相对位置，确定了FEC的最佳构象。接着，选择了AtF6′H中与FEC结合口袋6Å范围内的11个残基作为改造目标。通过饱和突变扫描，确定了L141、Q144和N311为关键位点。突变体L141G、Q144N和N311G相较于野生型AtF6′H，其相对活性分别提高了75%、78%和75%。

图4. 计算分析揭示催化效率提高的机制

研究人员通过计算分析揭示了AtF6′H表面突变体D5和口袋突变体S3如何通过影响酶结构和动态来提高其催化效率。对于表面突变体D5，与WT相比，新形成的氢键和盐桥可能通过稳定蛋白质结构来提高催化活性。分子动力学模拟显示，D5中FEC的结合更稳定，RMSD值更低，表明其在催化过程中具有更高的稳定性。而对于口袋突变体S3，L141N/Q144D/N311G的组合突变使得结合口袋更开放和灵活，有利于底物的进入和产物的释放。此外，N311G突变改变了FEC的结合方向，使其更有利于形成催化活性构象。

图5. 使用突变体在大肠杆菌中合成简单的香豆素

进一步，研究人员在大肠杆菌中利用筛选出的CCH突变体进行简单香豆素的从头合成。首先构建了菌株W1、B1和B2，它们分别表达了AtF6′H野生型和突变体S3与D5。结果显示，B1和B2菌株生产的香豆素分别达到49.3 mg/L和43.2 mg/L，分别是W1菌株产量的8.3倍和7.3倍。此外，为了合成2号化合物（伞形花内酯）和3号化合物（伞形酮），研究人员构建了W2、B3、W3和B4菌株，并分别表达了不同的CCH变异体。B3和B4菌株的产量分别达到78.4 mg/L和143.3 mg/L，分别是W2和W3菌株产量的5.1倍和21.5倍。

图6. 在分批补料发酵中菌株B3生产伞形花内酯

接下来，研究人员进行分批补料发酵实验以评估2号化合物（伞形花内酯）生产潜力和菌株B3的产量随时间的变化情况。实验设定了初始葡萄糖浓度为20 g/L，并在发酵过程中保持葡萄糖浓度低于10 g/L。结果显示，在120小时内，2号化合物的滴定量逐步增加，最终达到了855.5 mg/L的最大滴定量。此外，B3菌株的最大OD600值为36.5，这表明尽管2号化合物的产量得到了显著提升，但其对大肠杆菌的生长可能存在一定的毒性限制。

图7. 通过路径扩展生产香豆素葡萄糖苷

最后，通过在大肠杆菌中扩展代谢途径，研究人员实现了香豆素葡萄糖苷的从头合成。首先将UGT92G7基因引入菌株B3，生成菌株B5，成功实现了4号化合物（芸香素）的从头合成，产量达到254.8 mg/L，比之前的研究提高了15.7倍。在进行分批补料发酵实验时，4号化合物的产量进一步增加至2990.1 mg/L。此外，研究人员还成功地将TOGT基因引入菌株B3和B1，生成菌株B6和B7，实现了5号化合物（洋地黄毒苷）和6号化合物（黄芩苷）的从头合成，产量分别为73.9 mg/L和82.9 mg/L。这些结果表明，通过在大肠杆菌中引入合适的糖基转移酶，可以有效地扩展代谢途径，实现香豆素葡萄糖苷的高效生物合成。

总之，这项工作不仅突破了香豆素生物合成的主要瓶颈，还为香豆素的大规模生产提供了重要的一步。通过蛋白质工程改造的CCHs展示了其在生物合成中的潜力，为合成生物学领域提供了新的策略和方法。这不仅有助于推动可持续生产植物天然产物的进程，也为未来合成生物学在医药、化妆品和其他工业领域的应用开辟了新的可能性。

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