清华大学改造谷棒菌高效合成γ-羟基丁酸酯

科技 2024-10-24 16:30 上海

在面对全球能源危机和环境污染的双重挑战下，生物制造产业因其可持续性而受到广泛关注。特别是在生产四碳平台化学品，如γ-羟基丁酸酯（GHB）和γ-丁内酯（GBL）等高附加值化合物方面，传统的化石资源依赖型生产方式正逐渐被基于可再生资源的生物合成途径所取代。GHB作为一种重要的四碳平台化学品，广泛应用于医药、化工等多个领域，但其生产过程亟需更加环保和经济的生物制造策略。

图1. 代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌高效合成γ-羟基丁酸酯

2024年10月22日，来自清华大学化学工程系工业生物催化教育部重点实验室的陈振副教授在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Metabolic Engineering of Corynebacterium glutamicum for the Production of the Four-Carbon Platform Chemicals γ-Hydroxybutyrate and γ-Butyrolactone”的研究论文，该团队通过代谢工程手段改造谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum），实现了从葡萄糖到GHB的生物合成。研究团队通过引入谷氨酸衍生途径，筛选关键酶，阻断副产物合成途径，并整合非氧化糖酵解（NOG）途径，最终开发出一株工程菌株，在批式发酵中GHB产量达到38.3 g/L，产率0.615 mol/mol葡萄糖。此外，该研究还通过酸处理将发酵液中的GHB高效转化为GBL，产率达到0.970 mol/mol GHB，展示了从可再生资源到高值化学品的完整生产流程。

图2. 不同浓度GHB对大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌生长的影响

研究人员首先探究了不同浓度GHB对大肠杆菌（E. coli MG1655）和谷氨酸棒状杆菌（C. glutamicum S9114）生长的影响。研究发现，当GHB浓度超过5 g/L时，E. coli的生长速率和最终细胞密度显著下降（p < 0.001），而C. glutamicum即使在高达10 g/L的GHB浓度下，其生长几乎不受影响，与对照组相比没有统计学上的显著差异。在GHB浓度超过20 g/L时，C. glutamicum出现延长的滞后期和降低的生长速率，但最终细胞密度与对照组相当或略高，表明C. glutamicum对GHB具有更高的耐受性，因此是更适宜用于GHB生物合成的宿主菌株。

图3. 通过代谢通量分析比较两条不同的GHB生物合成途径

接下来，通过代谢通量分析（FBA）比较了两条不同的GHB生物合成途径：基于琥珀酰辅酶A的途径和基于谷氨酸的途径。分析显示，理论上通过琥珀酰辅酶A途径获得的GHB产率为1.33 mol/mol葡萄糖，高于基于谷氨酸途径的1.0 mol/mol。然而，这一高产量是基于三羧酸循环（TCA循环）的还原和氧化分支同时激活的假设，这在实际代谢调控和热力学限制下很难实现。当仅依赖TCA循环的还原或氧化分支时，GHB的最大理论产量降至1.07或1.0 mol/mol葡萄糖，与基于谷氨酸途径的产量相似。此外，考虑到C. glutamicum能够有效地产生L-谷氨酸，并且基于谷氨酸途径的酶对氧气不敏感，研究人员最终选择了基于谷氨酸的途径进行GHB的生产。通过在该途径中整合非氧化糖酵解（NOG）途径，基于谷氨酸途径的GHB最大理论产量可提高至1.2 mol/mol葡萄糖，与基于琥珀酰辅酶A途径的理论产量相当。

图4. 在谷氨酸棒状杆菌中构建GHB生物合成途径

研究人员在C. glutamicum中构建GHB生物合成途径。首先将突变的谷氨酸脱羧酶基因gadB^{E89QΔ465−466}与γ-氨基丁酸转氨酶基因gabT和醇脱氢酶基因yqhD共表达，成功转化到C. glutamicum S9114中，构建了工程菌株HB0。在批式发酵中，HB0菌株能够产生0.69 g/L的GHB。然而，在发酵过程中观察到副产物如乙酸、乳酸和琥珀酸的显著积累。特别是琥珀酸的积累，推测是由于内源醛脱氢酶将琥珀醛氧化为琥珀酸所致。为了减少琥珀酸积累，研究者们通过基因编辑敲除了三个候选的琥珀醛脱氢酶基因gabD1、gabD2和gabD3，创建了HB1、HB2和HB3菌株。其中，敲除gabD1的HB1菌株在发酵中显著减少了琥珀酸积累（从HB0的5.1 g/L降至1.3 g/L），并将GHB产量提高至19.1 g/L，产率为0.297 mol/mol葡萄糖，证实了gabD1在琥珀酸积累中的主导作用。

图5. 基因编辑减少乳酸和乙酸积累优化GHB生产过程

进一步，研究人员通过基因编辑减少乳酸和乙酸积累。首先敲除了乳酸脱氢酶基因ldh，创建了HB4菌株，这一改造消除了乳酸积累，并在发酵过程中减少了乙酸的产生。HB4菌株的GHB产量提升至30.6 g/L，产率达到0.490 mol/mol葡萄糖。为了进一步减少乙酸积累，研究人员尝试敲除磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因pta-ackA或丙酮酸氧化酶基因poxB，分别创建了HB5和HB6菌株。然而，这些改造并没有显著降低乙酸水平，反而导致GHB产量下降，表明这些基因的敲除显著扰乱了代谢通量分布。此外，通过转录组分析鉴定了其他可能参与琥珀醛氧化的醛脱氢酶基因ald1、ald2和ald3。敲除ald1基因的HB7菌株显著减少了琥珀酸积累，并将GHB产量提升至33.7 g/L，产率为0.524 mol/mol葡萄糖。而敲除ald2基因的HB8菌株GHB产量大幅下降，乙酸积累增加，因此HB7菌株被选为进一步研究的对象。

图6. 通过筛选关键途径酶提高GHB产量

接着，研究人员筛选能够提高GHB产量的关键途径酶。首先广泛评估了一系列转氨酶和醇脱氢酶，这些酶能够催化将谷氨酸转换为GHB的步骤。在对来自不同物种的十种转氨酶编码基因进行初步筛选后，发现大多数替换并没有显著提升GHB的产量。进一步在生物反应器中对这些菌株进行详细评估后，只有含有Pseudomonas putida中patA基因的HB4.7株在批式发酵中的GHB产量与原始HB4株相当（30.59 g/L对比30.55 g/L）。因此，原始的E. coli gabT基因被保留用于进一步研究。随后，研究者探究了三种来自E. coli的醇脱氢酶对GHB产量的影响，这些酶以NADPH为辅酶，先前报道显示它们在还原中等链长的醛类上具有高活性。含有yjgB基因的重组菌株HB4.12在摇瓶发酵中展现了GHB产量的提升，但在后续的生物反应器批式发酵中，产量仅10.3 g/L，表明可能由于溶解氧水平的差异导致结果不一致。替换yqhD基因为yahK或yihU也没有增加GHB产量，因此保留了yqhD基因进行后续实验。

图7. 通过敲除特定醛脱氢酶基因减少琥珀酸积累提高GHB产量

研究人员通过筛选其他潜在的醛脱氢酶来进一步减少琥珀酸积累。尽管在HB0菌株中敲除gabD1基因显著降低了琥珀酸积累并增加了GHB产量，但在HB4菌株的发酵过程中仍有约1.3 g/L的琥珀酸积累，这表明可能有其他内源性脱氢酶参与了琥珀醛的氧化过程。通过比较HB4和HB1之间的转录组分析，研究人员鉴定了三个上调的基因，它们编码可能的醛脱氢酶，分别为ald1、ald2和ald3。在HB4菌株中分别敲除这些基因，创建了HB7、HB8和HB9菌株。结果显示，敲除ald1基因的HB7菌株显著减少了琥珀酸积累，并提高了GHB产量至33.7 g/L，产率为0.524 mol/mol葡萄糖。敲除ald3基因的HB9菌株降低了琥珀酸积累，但GHB产量未变（30.4 g/L）。然而，敲除ald2基因的HB8菌株GHB产量大幅下降至10.6 g/L，并且乙酸积累显著增加至17.0 g/L。因此，敲除ald1基因的HB7菌株被选为进一步研究的对象。

图8. 通过整合非氧化糖酵解途径进一步提高GHB产量

最后，研究人员通过整合非氧化糖酵解（NOG）途径进一步提高GHB产量。首先将来自Bifidobacterium adolescentis的磷酮醇酶基因pk及其突变体pk^{T2A/I6T/H260Y}导入HB7菌株染色体，并置于tuf或H36启动子的控制之下。结果表明，含有野生型pk基因并由H36启动子驱动的HB13菌株，在发酵过程中显著提高了GHB产量，达到38.3 g/L，产率为0.615 mol/mol葡萄糖，同时副产物积累极少。这一产量和产率在无需复杂发酵优化的情况下，与文献报道的最高水平相当。相比之下，其他菌株并未显示出GHB产量的提升，强调了精确调控NOG途径表达对于优化代谢通量分布的重要性。虽然通过这一策略获得的GHB产量和产率尚未达到理论最大值，但已经接近，并展示了通过微生物发酵和简单的酸处理过程，从可再生原料中可持续生物制造GHB和GBL的潜力。

总之，这项工作通过利用谷氨酸棒状杆菌的天然优势和代谢工程的创新，不仅在实验室规模上取得了显著成果，更为工业规模的GHB和GBL生产提供了新的可能性。该研究为实现可再生资源的高值化利用，推动生物制造产业的绿色转型提供了强有力的技术支持，同时也为其他四碳化学品的生物合成提供了新的思路和方法。

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