浙工大代谢工程改造新金分枝杆菌高效合成宝丹酮

科技 2024-11-21 16:30 上海

宝丹酮（Boldenone），一种重要的蛋白同化激素，具有促进肌肉生长、增强骨密度以及在运动员中用于非赛季肌肉维持等生理功能，传统的宝丹酮合成方法依赖于化学过程，成本高且对环境有负面影响。因此，急需开发一种更可持续且经济的生物合成途径，以满足宝丹酮在治疗肌肉损伤、骨质疏松症以及运动员肌肉增长等方面的需求。

2024年11月17日，来自浙江工业大学手性化学品生物制造国家与地方联合工程研究中心的郑裕国院士和柳志强教授在《Biotechnology Journal》杂志发表了题为“Construction of a Cell Factory for the Targeted and Efficient Production of Phytosterol to Boldenone in Mycobacterium neoaurum”的研究论文，该团队通过酶工程和代谢工程显著提高了17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSD）和3-酮类固醇-Δ1-脱氢酶（KstD）的催化性能，并在菌株新金分枝杆菌（M. neoaurum）中增强了它们的表达。这些改进使宝丹酮的产量增加到4.05 g/L，同时显著减少了副产物的生成。为了进一步提高产量，研究人员构建了多酶融合表达系统，并敲除了关键的细胞壁基因kasB，使宝丹酮的时空产量达到1.02 g/(L⋅d)。通过优化转化系统，宝丹酮的产量进一步增加到5.56 g/L，时空产量达到1.39 g/(L⋅d)。这一绿色生物合成路线为宝丹酮的工业化生产奠定了基础。

图1. 通过理性设计提高17β-HSD酶活性

研究团队首先从NCBI数据库中筛选出多个17β-HSD候选酶，并通过实验验证了它们在新金分枝杆菌中的活性。其中，来自B. naardenensis的17β-HSDbn表现出最高的相对活性，达到了野生型菌株的155.51%。进一步的优化实验确定了17β-HSDbn的最佳活性pH为7.5，最佳温度为37°C。通过分子对接和关键氨基酸位点的筛选，研究人员设计了17β-HSDbn的突变体，其中N222W突变体的活性最高，达到了野生型活性的234.41%。

图2. 17β-HSDbn突变体在新金分枝杆菌中表达对宝丹酮合成的影响

研究人员发现，与野生型菌株相比，17β-HSDbn^N222W和17β-HSDbn^G151Y突变体分别将宝丹酮产量提高了43.48%和56.52%，分别达到了2.64 g/L和2.88 g/L的产量。此外，通过共表达内源的g6pdh基因和外源的17β-hsdbn^G151Y基因，构建了一个高效的NADPH自给循环，使得工程菌株的宝丹酮产量达到了3.26 g/L，比对照菌株高出13.19%。进一步的实验表明，添加10 g/L的葡萄糖可以使得宝丹酮产量在72小时内达到3.53 g/L，比对照组提高了8.28%。

图3. KstD的筛选、突变增强及其在新金分枝杆菌中应用

接下来，研究人员从文献中筛选出七个具有高活性的KstD序列，并在大肠杆菌中进行了重组表达。通过比较不同来源的KstD活性，发现来自S. haloaromaticamans的ShKstD表现出较高的活性。进一步的结构分析和分子对接揭示了ShKstD的关键氨基酸残基，为后续的位点饱和突变提供了基础。突变后的ShKstDS161A表现出比野生型更高的相对活性，达到了165.6%。将ShKstD敲入新金分枝杆菌基因组后，特别是MNΔkshA2::Shkstd^S161A工程菌株，在144小时内宝丹酮产量达到了4.46 g/L，比对照菌株高出10.12%，同时显著减少了副产物雄酮（AD）和雄烯二酮（TS）的生成，分别降低了36.11%和19.36%。

图4. 多酶融合表达系统对宝丹酮产量影响的研究

进一步，研究人员利用酶融合技术将不同的酶结合起来，形成了一个多功能的生物催化剂，用于催化级联反应。通过预测17β-HSDbn^G151Y为跨膜蛋白，并使用甘氨酸-丝氨酸链接器将ShKstD^S161A或G6PDH与17β-HSDbn^G151Y融合并锚定到细胞膜上，以减少酶的运输并加速产品转化。实验结果表明，g6pdh与17β-HSDbn^G151Y的双酶融合体系显著提高了宝丹酮的产量至5.11 g/L，比对照组提高了14.57%，摩尔转化率达到了73.99%。这种效率的提高归因于底物通道效应，即一个酶的产物直接转移到第二个酶的活性位点，比随机扩散更快。尝试三酶融合时，却发现产量有所下降，可能是由于三酶融合中的蛋白质错误折叠，这对于功能和稳定性至关重要，以及复杂的代谢途径需要精确的调节。因此，研究团队选择了g6pdhLo17β-hsdbn^G151Y双酶融合系统进行进一步研究，这一系统在优化的全细胞生物转化系统中，宝丹酮产量达到了5.56 g/L，摩尔转化率为80.50%，生产率提高了36.27%。

图5. 转化系统优化对宝丹酮产量的影响

最后，研究人员通过调整不同的生长阶段、生物量和底物浓度，以及溶解氧和pH值，来优化生物转化过程。结果显示，收获于稳定生长期（48小时）的细胞具有最高的转化效率和宝丹酮产量，比对照组提高了10.74%。在生物量优化方面，65 g/L的生物量展现了最佳的转化效率，宝丹酮产量提前24小时达到峰值，时空产量提高了25.76%。底物浓度的优化表明，10 g/L的底物浓度在96小时内具有最高的摩尔转化率73.73%，副产物水平较低。溶解氧的优化发现，20 mL的反应体积增加了摩尔转化率，而pH值的优化显示，pH 8.5时摩尔转化率达到80.44%，比对照组提高了6.63%。在最佳条件下，即20 mL反应体积、pH 8.5、65 g/L的稳定期细胞和10 g/L的植物甾醇作为底物，宝丹酮产量在96小时内达到5.56 g/L，摩尔转化率为80.50%，时空产量提高了36.27%，副产物ADD和TS低于0.4 g/L，且AD完全消除。这些优化措施显著提高了宝丹酮的生产效率和产品质量，为工业化生产提供了有力的技术支持。

总之，这项工作不仅展示了通过代谢工程和酶工程改造微生物以实现高效生物合成的可能性，还为未来的工业生产提供了可行的绿色替代方案。通过优化酶的催化特性和代谢路径，研究团队成功地将植物甾醇高效转化为宝丹酮，显著提高了产量并减少了环境影响。这一突破性成果不仅有助于满足市场对宝丹酮的需求，还为其他生物活性类固醇化合物的绿色生产提供了宝贵的经验和方法。

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