江南大学代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌高效合成L-蛋氨酸

科技 2024-10-08 16:30 上海

在全球化的农业与食品工业中，L-蛋氨酸扮演着至关重要的角色，它不仅参与了生物体的免疫反应，促进T淋巴细胞的增殖和转化，而且在DNA和蛋白质的合成及翻译后修饰中发挥着核心作用。尽管目前通过化学合成方法可以大规模生产L-蛋氨酸，但这种方法依赖于化石燃料衍生的甲基巯基，并非完全基于生物的方法。因此，开发一种环保且高效的L-蛋氨酸生产方法成为了科学研究的热点。

图1. 代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌高效合成L-蛋氨酸

2024年10月7日，来自江南大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室的王小元教授在《Systems Microbiology and Biomanufacturing》杂志发表了题为“Multi-step metabolic engineering Corynebacterium glutamicum ATCC13032 to produce L-methionine”的研究论文，该团队通过多步代谢工程策略，成功地在谷氨酸棒杆菌中促进了L-蛋氨酸的合成。研究团队通过消除关键限速酶的反馈抑制、阻断L-苏氨酸生物合成、加强L-高丝氨酸下游途径等策略，使得菌株ZBW011/pEC-metYX能够产生1.82 g/L的L-蛋氨酸。最终，通过敲除pyk2基因并过表达metYX基因，得到的工程菌株ZBW014/pEC-metYX在2.4升发酵罐中能够产生高达7.06 g/L的L-蛋氨酸，创造了新的记录。

图2. 通过逐步遗传改造提高L-蛋氨酸产量的实验流程

研究人员从谷氨酸棒杆菌ATCC13032出发，经rpsL^K43R突变后，发现并未对生长或L-蛋氨酸浓度产生影响。随后，通过过表达hom和lysC基因以及引入hom^G378S突变，得到的ZBW002菌株能够积累0.6 g/L的L-苏氨酸，但并未检测到L-高丝氨酸和L-蛋氨酸的产生。进一步通过敲除thrB基因，ZBW003菌株的L-蛋氨酸产量提升至0.31 g/L，表明阻断L-苏氨酸合成途径，可以促进代谢流向L-蛋氨酸的生物合成。继续敲除mcbR和metD基因后，ZBW004和ZBW005菌株的L-蛋氨酸产量分别增加至0.37 g/L和0.49 g/L，显示了关键基因敲除在代谢重定向中的作用。通过增强草酰乙酸的供应和过表达brnFE基因，ZBW006和ZBW007菌株的产量进一步提升，最终通过敲除Ncgl2640基因，ZBW009菌株实现了0.92 g/L的产量，表明解除代谢抑制在提高L-蛋氨酸产量中的重要性。

图3. 通过增强关键酶活性进一步提升L-蛋氨酸产量

接下来，研究人员通过增强L-蛋氨酸生物合成途径中的关键酶活性来进一步提高L-蛋氨酸产量。通过在ZBW010菌株中过表达metH基因并替换其启动子，成功地将L-蛋氨酸的产量从ZBW009的0.92 g/L提高到了1.16 g/L。这一步骤通过增加甲硫氨酸合成酶的活性，促进了从同型半胱氨酸到L-蛋氨酸的转化。

图4. 在谷氨酸棒杆菌中过表达特定基因对L-蛋氨酸产量的影响

接着，通过在ZBW011菌株中过表达aecD基因，该基因编码的酶参与将同型半胱氨酸转化为L-蛋氨酸的关键步骤，进一步将L-蛋氨酸的产量提高到了1.59 g/L，比ZBW010菌株高出37%。此外，研究人员还探索了metX、metY、metYX、metB和metE基因的过表达，发现在ZBW011/pEC-metYX菌株中同时过表达metX和metY基因，可以将L-蛋氨酸的产量提高至1.82 g/L，这比单独过表达任一基因都要有效。此外，研究人员还发现过表达metF基因反而导致L-蛋氨酸产量下降了39%，在ZBW012菌株中仅达到1.14 g/L，这表明过度干预代谢途径可能会破坏细胞内的代谢平衡。

图5. 敲除特定基因对谷氨酸棒杆菌产生L-蛋氨酸的影响

进一步，研究人员在ZBW011菌株中敲除了sucCD和pyk2基因，其中，sucCD基因的敲除导致ZBW013菌株的L-蛋氨酸产量下降了30%，仅为1.22 g/L，这可能是由于L-蛋氨酸生物合成中乙酰辅酶A的乙酰化反应受到抑制。而pyk2基因的敲除则在ZBW014菌株中取得了相反的效果，L-蛋氨酸产量提高了14%，达到了1.81 g/L，这可能是由于敲除pyk2基因增加了L-蛋氨酸前体的供应。这些结果表明，通过基因删除来优化代谢途径可以有效地提高目标产物的产量，但同时也需要仔细考虑基因删除对整个代谢网络的影响。

图6. 在ZBW014菌株中过表达metYX基因提高L-蛋氨酸产量

由于metYX基因编码的酶负责催化将O-乙酰高丝氨酸和硫化氢直接转化为高半胱氨酸，是L-蛋氨酸生物合成中的关键步骤。因此，研究人员在ZBW014菌株中过表达metYX基因来提升L-蛋氨酸产量。实验结果表明，与对照组相比，转入pEC-metYX质粒后的ZBW014/pEC-metYX菌株在60小时时L-蛋氨酸的产量显著增加至2.04 g/L，增幅达到17%。此外，L-高丝氨酸的浓度也从3.91 g/L下降至3.33 g/L，这一变化进一步证实了过表达metYX基因能够更有效地将代谢前体转化为目标产物L-蛋氨酸。

图7. 优化培养条件提高摇瓶发酵中L-蛋氨酸产量

研究人员通过增加接种量和扩大发酵体积进一步促进L-蛋氨酸的生物合成。在优化的培养条件下，ZBW014/pEC-metYX菌株在48小时内实现了高达2.4 g/L的L-蛋氨酸产量，这一结果不仅比未优化条件下的产量高出许多，也显示了通过精细调控培养条件来增强微生物生产效率的巨大潜力。此外，L-高丝氨酸和L-赖氨酸的浓度变化也反映了代谢网络的重构和优化。

图8. 发酵罐中进行的分批补料发酵实验提升L-蛋氨酸产量

最后，研究人员使用ZBW014/pEC-metYX菌株在2.4升发酵罐中进行分批补料发酵实验。实验中，维持了适宜的温度和溶解氧水平，并调整了pH值，以保持最佳的发酵条件。通过连续补充葡萄糖，维持了5至20 g/L的葡萄糖浓度，确保了菌株能够持续生长和生产L-蛋氨酸。在96小时的发酵过程中，ZBW014/pEC-metYX菌株的细胞密度稳定增长，最终OD₅₆₂值达到了74。最为引人注目的是，通过这种优化的分批补料发酵策略，L-蛋氨酸的产量最终达到了7.06 g/L，刷新了之前摇瓶发酵条件下的记录。

总之，这项研究不仅为工业规模生产L-蛋氨酸提供了新的可能性，而且展示了合成生物学在可持续生产必需氨基酸方面的潜力。通过利用可再生资源和绿色发酵技术，该研究朝着减少对化石燃料的依赖、降低生产成本以及减少环境污染的方向迈出了坚实的一步，不仅对食品、农业和制药行业具有重要意义，也为全球可持续发展目标的实现贡献了力量。

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