在现代生物技术领域，通过微生物细胞工厂生产高附加值的化学品正受到越来越多的关注。L-高丝氨酸作为一种重要的平台化合物，在工业、农业和医药领域有着广泛的应用前景。传统的化学合成方法由于成本高和环境污染问题，限制了L-高丝氨酸的生产规模和应用范围。随着基因编辑技术的发展，通过工程化大肠杆菌生产L-高丝氨酸的方法成为了研究的热点。然而，提高L-高丝氨酸的产量和生产效率，需要对大肠杆菌的代谢途径进行精细的调控。 图1. 代谢工程改造大肠杆菌高效合成L-高丝氨酸 2024年10月18日，来自浙江工业大学手性化学品生物制造国家与地方联合工程研究中心的郑裕国院士和柳志强教授在《Biotechnology and Bioengineering》杂志发表了题为“Adjustment of the main biosynthesis modules to enhance the production of l-homoserine in Escherichia coli W3110”的研究论文，该团队通过调整大肠杆菌W3110的主要生物合成模块，显著提高了L-高丝氨酸的生产效率。研究团队将L-高丝氨酸的生物合成途径划分为三个模块：葡萄糖摄取和上游途径、下游途径以及能量供应模块。通过代谢组学分析，发现宿主菌株的能量供应不足，尤其是ATP的供应。因此，首先对能量供应模块进行了改造，通过平衡ATP供应，L-高丝氨酸的产量增加了66%，达到了12.55克/升。进一步的研究表明，上游途径存在堵塞，通过提高培养温度到37°C解决了这一问题，L-高丝氨酸的产量达到了21.38克/升。接着，通过加强下游合成途径来平衡通量，L-高丝氨酸的产量达到了32.55克/升，这是迄今为止报道的最高水平。最终，在5升生物反应器中进行的补料发酵实验中，L-高丝氨酸的产量达到了119.96克/升，葡萄糖的产率达到了0.41克/克，生产率为1.31克/升/小时。 图2. 通过增强能量供应相关基因表达改善L-高丝氨酸生物合成效率 研究团队首先通过替换原有启动子为Ptrc，增强了pgk基因的表达，从而促进了从1,3-二磷酸甘油酸到3-磷酸甘油酸的底物水平磷酸化过程。这一改变显著提高了L-高丝氨酸的产量，达到了8.97克/升。此外，通过增强sucAB基因的表达，尽管对L-高丝氨酸产量的提升并不显著，但却促进了细胞生长，这可能是由于碳流大量流入细胞生长过程中，而非L-高丝氨酸的合成途径。进一步，通过在HS1和HS2菌株基础上增强aspA基因的表达，旨在将碳流引入L-高丝氨酸合成途径，但结果却表明，这一策略导致了细胞生长与L-高丝氨酸生产的失衡，尤其是在HS4菌株中，L-高丝氨酸产量显著下降。 图3. 扩展腺苷酸池并减少能量消耗有效提升了L-高丝氨酸的产量 研究团队通过敲除add基因和amn基因，分别在HS5和HS6菌株中实现了L-高丝氨酸产量的38%和27%的提升，产量分别提高至9.23克/升和10.15克/升。进一步地，同时敲除这两个基因，在HS7菌株中将L-高丝氨酸产量提升至10.3克/升，比原始菌株HS提高了40%。此外，通过在HS7菌株中异源表达酵母中的ado1基因，得到了HS8菌株，并将L-高丝氨酸的产量进一步提升了66%，达到了12.15克/升。 图4. 通过敲除调控基因减少ATP消耗提高了L-高丝氨酸的产量研究人员发现，通过敲除控制细菌鞭毛合成的flhC基因，可以减少ATP的消耗，从而将更多的能量用于L-高丝氨酸的合成。这一策略在HS9菌株中得到了验证，结果显示L-高丝氨酸的产量提高了25%，达到了10.44克/升。此外，通过在HS8菌株中整合增强的pgk基因和敲除的flhC基因，得到的HS10和HS11菌株虽然细胞内ATP浓度有所提高，但L-高丝氨酸的产量并没有进一步提升，表明在HS8菌株中，L-高丝氨酸的生产已经不再受到ATP供应的限制。 图5. 加强L-高丝氨酸下游合成途径导致残余葡萄糖浓度升高研究人员在HS8菌株基础上，通过增强aspC、thrA、asd和rhtB基因的表达，构建了HS12至HS15系列菌株，目的是通过提高从草酰乙酸(OAA)到L-高丝氨酸的代谢通量来增加产量。然而，结果出乎意料，这些改造并没有提高L-高丝氨酸的产量，反而使其较HS8菌株有所下降。特别是HS15菌株，其L-高丝氨酸产量下降最为显著。此外，与HS8菌株相比，这些菌株的发酵液中残余葡萄糖浓度普遍较高，表明上游途径可能存在堵塞，影响了L-高丝氨酸的合成效率。这一发现提示，单纯加强下游途径并不能有效提高L-高丝氨酸的产量，需要综合考虑上下游途径的协同作用。通过提高培养温度至37°C，可以显著提高L-高丝氨酸的产量，如HS14菌株在37°C条件下产量可达21.38克/升，较30°C提高了77.7%。 图6. 动态调节ptsG基因并未改善L-高丝氨酸的产量研究团队在HS菌株中利用动态启动子PfliA和弱启动子Pdapa重新引入ptsG基因，旨在提高葡萄糖的摄取效率，进而增强EMP途径的活性。然而，实验结果显示，重新引入ptsG基因的HS16和HS17菌株并没有表现出预期的产量提升，反而L-高丝氨酸的产量有所下降，同时细胞生长和葡萄糖摄取率也有所降低。特别是在HS17菌株中，L-高丝氨酸的产量和残余葡萄糖浓度的下降更为明显，这表明葡萄糖摄取的改善并不是提高产量的关键因素，而EMP途径的效率可能存在问题。 图7. 提高培养温度至37°C有助于增强EMP途径效率研究人员通过提高培养温度至37°C来增强EMP途径的效率，以此提高L-高丝氨酸的产量。实验结果表明，提高培养温度能够显著促进L-高丝氨酸的生产，其中HS14菌株在37°C条件下的产量达到了21.38克/升，相较于30°C时的产量提高了77.7%。此外，残余葡萄糖浓度在37°C时也有所下降，这进一步证实了提高温度有助于改善L-高丝氨酸合成途径的效率。 图8. 整合调控上下游途径以及平衡代谢通量提高L-高丝氨酸产量研究人员在HS13和HS14菌株基础上，单独或多重整合调控下游相关基因，构建了HS18至HS24系列菌株。结果显示，单纯加强aspC和asd基因的表达并未对L-高丝氨酸产量产生显著影响（HS18、HS19和HS22菌株）。然而，通过增强rhtB基因表达来提高L-高丝氨酸的外排效率，HS20、HS21、HS23和HS24菌株的L-高丝氨酸产量有所提升。特别是HS24菌株，整合了aspC、thrA、asd和rhtB基因的调控，L-高丝氨酸产量可达24.6克/升。进一步优化初始葡萄糖浓度，L-高丝氨酸产量可提高至29.2克/升。 图9. 加强PEP到OAA的代谢途径以及过表达ppc基因提升L-高丝氨酸产量研究人员在HS24菌株基础上，通过敲除pykA基因、引入crp突变基因以及过表达ppc基因，构建了HS25、HS26和HS27菌株。结果显示，过表达ppc基因的HS27菌株能够有效提高L-高丝氨酸的产量，最高可达32.55克/升，而敲除pykA基因和引入crp突变基因并未对L-高丝氨酸积累产生积极影响。这表明加强PEP到OAA的代谢途径对于提高L-高丝氨酸的生物合成具有积极作用，但敲除PEP到PYR的代谢途径并未使更多的碳流转向L-高丝氨酸的下游合成途径。 图10. 在5L生物反应器中进行分批补料发酵最后，研究人员在5升生物反应器中进行的补料发酵实验，用于放大HS27菌株的L-高丝氨酸生产。在为期92小时的发酵过程中，细胞生长在20小时后进入了稳定期，OD600值在此后的培养过程中维持在大约60左右。与此同时，L-高丝氨酸的产量持续增长，呈现出与细胞生长解耦的趋势，最终达到了119.96克/升的最高产量。整个过程中，L-高丝氨酸的产率和生产率分别达到了0.41克/克葡萄糖和1.31克/升/小时，这些数据代表了目前报道的最高生产水平。尽管如此，研究结果也指出了在5升生物反应器中进行的放大培养仍有改进空间，较低的产率和较长的生产周期限制了其工业应用潜力，因此，进一步优化发酵过程和缩短发酵时间是未来工作的重点。总之，这项研究不仅为L-高丝氨酸的微生物发酵生产提供了坚实的研究基础，而且其成果具备工业应用的潜力。通过系统的代谢工程改造，研究人员展示了如何通过调节微生物的代谢途径来提高目标化合物的产量，这对于生物制造产业具有重要的意义。这一成果体现了生物技术在可持续化学生产中的巨大潜力，为未来绿色化学和生物基产品的开发提供了新的思路和方法。
