江苏大学代谢工程改造大肠杆菌高效合成3-羟基丙酸

科技 2024-09-28 16:30 上海

在全球化石燃料日益枯竭和环境污染问题日益严重的今天，开发可持续的生物制造途径以替代传统化学合成方法生产化工原料和燃料变得尤为重要。3-羟基丙酸（3-HP）作为12种具有高价值的平台化学品之一，在化学、食品和化妆品工业中具有广泛的应用前景。然而，3-HP的生物合成面临着底盘生物鲁棒性不足和发酵过程成本高昂的双重挑战。为了克服这些难题，科学家们一直在探索如何通过代谢工程和发酵过程优化来提高3-HP的生产效率和经济性。

图1. 代谢工程改造大肠杆菌高效合成3-羟基丙酸

2024年9月25日，来自江苏大学的孙文敬研究员、齐向辉教授与广州大学的翟彼得教授联合在《ACS Synthetic Biology》杂志发表了题为“Bioproduction of 3-Hydroxypropionic Acid by Enhancing the Precursor Supply with a Hybrid Pathway and Cofactor Regeneration”的研究论文，该团队通过混合途径和辅因子再生增强前体供应来生物法合成3-羟基丙酸。研究人员首先在大肠杆菌中招募并重新平衡了丙酰辅酶A（MCA）途径，然后通过整合糖酵解（EMP）途径与非氧化糖酵解途径，增强了碳通量到MCA途径，并进行了NADPH再生的微调。通过优化发酵条件，3-HP产量得到了显著提高，实验室规模的发酵达到了6.8 g/L。在进一步的分批补料发酵实验中，最终底盘产生了42.8 g/L的3-HP，对应于0.4 mol/mol的产率和0.6 g/(L·h)的生产率。

图2. 大肠杆菌中3-HP生物合成的MCA途径

研究人员在大肠杆菌中通过丙酰辅酶A（MCA）途径生物合成3-HP。首先，通过在BL21菌株中表达MCR酶，实现了从葡萄糖到3-HP的转化，其中ECM 01菌株从20 g/L葡萄糖中产生了0.3 g/L的3-HP，产率约为0.1 mol/mol。为了进一步提升3-HP的产量，研究人员对MCR-C基因进行了突变（N940V/K1106W/S1114R），创建了ECM 02菌株，其产量提高到了0.6 g/L，产率保持不变。

图3. 通过代谢途径重平衡和前体供应增强来提升3-HP生物合成

接下来，研究人员通过平衡生物合成途径和增强前体供应来提高3-HP产量。通过改变mcr-n和mcr-c^M基因在不同拷贝数质粒中的表达，成功构建了ECR系列菌株，其中ECR 02表现出最佳的3-HP生产性能，产量达到了0.9 g/L，产率提升至0.2 mol/mol。进一步地，通过在ECR 02基础上引入accADBC基因，构建了ECM 03菌株，其3-HP产量提升至1.5 g/L，产率维持在0.2 mol/mol。此外，通过比较不同菌株的生长曲线和副产物（乙酸）的生成情况，研究人员发现ECM 03的生长受到了一定影响，这可能是由于乙酰辅酶A向MCA的大量分流，减少了进入TCA循环的碳通量。

图4. EMP途径的调节和与NOG途径的协作

研究人员进一步通过调节EMP途径和结合NOG途径来增强前体供应来提升3-HP生物合成。首先构建了EMP-NOG混合途径，通过敲除ECM 03菌株中的pfkA基因，阻断了EMP途径的初步阶段，并引入了能够将葡萄糖转化为乙酰磷酸（AcP）的NOG途径，进而产生更多的乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）。由此产生的ECF 01菌株，在含有20 g/L葡萄糖的M9培养基中，其3-HP的滴度达到了2 g/L，产率为0.4 mol/mol，与ECM 03相比，分别提高了33.3%和100%。此外，ECF 01的副产物乙酸的产量也从ECM 03的5.2 g/L降低到了2.8 g/L，减少了46.2%，这表明混合途径有效提升了3-HP的合成效率并降低了副产物的积累。

图5. 基因表达水平的调控

研究人员通过5′-UTR工程调节基因表达水平来优化3-HP生物合成的过程。研究人员利用UTR Designer工具设计了不同的5′-UTR序列，以调节accADBC、fxpk、tal和actA基因的表达。通过这种策略，ECF 01菌株经过5′-UTR优化后得到的ECF 02菌株，在摇瓶发酵中3-HP的滴度和产率分别达到了2.4 g/L和0.4 mol/mol，与ECF 01相比，3-HP的滴度提高了约20%，而产率基本保持不变。此外，优化后的ECF 02菌株副产物乙酸的产量降低到了1.2 g/L，比ECF 01减少了57.1%，这表明通过精确调控基因表达，不仅能够提高目标产物的产量，还能有效控制副产物的生成，这对于工业生产过程中成本控制和产品质量至关重要。

图6. 辅因子优化以促进3-HP合成

接下来，研究人员通过优化NADPH供应来增强3-HP的生物合成。研究人员认识到MCR介导的MCA还原成3-HP的过程需要消耗NADPH，因此引入了NADP+依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gapN），以增强NADPH的供应。通过设计不同的5′-UTR序列来微调gapN的表达水平，成功构建了ECF 03、ECF 04和ECF 05三个重组菌株。在摇瓶发酵中，ECF 03表现出最佳的3-HP产量，达到了4 g/L，产率为0.6 mol/mol，与ECF 02相比，产量和产率分别提高了66.7%和50%。此外，ECF 03的副产物乙酸产量仅为0.9 g/L，比ECF 02的1.2 g/L减少了25%，证实了优化NADPH供应对提高3-HP合成效率和降低副产物积累的重要性。

图7. 发酵过程的优化

最后，研究人员通过发酵过程优化进一步提高3-HP产量。研究人员选择了ECF 03作为最终底盘，对其发酵条件进行了优化，包括IPTG的浓度和发酵培养基的组成。在摇瓶发酵中，0.05 mM IPTG的浓度被确定为最佳，此时ECF 03的3-HP产量达到了4.1 g/L，产率为0.7 mol/mol。进一步地，通过向M9培养基中添加微量金属溶液，优化后的培养基使得ECF 03的3-HP产量增加到了6.8 g/L，产率为0.7 mol/mol，与原始M9培养基相比，产量提高了65.9%。最终，在5L生物反应器中进行的 fed-batch 发酵实验中，ECF 03的3-HP产量达到了42.8 g/L，产率为0.4 mol/mol，生产率为0.6 g/(L·h)。这一系列的优化措施，不仅提升了3-HP的产量，也展示了通过系统代谢工程和发酵过程优化相结合的策略，在工业规模生产3-HP方面的巨大潜力。

总之，这项研究不仅在实验室规模上实现了3-HP生物合成的显著提升，而且为未来工业规模生产提供了重要的理论和实验基础。通过代谢工程和发酵过程优化相结合的策略，研究人员展示了如何将基础科学研究转化为具有实际应用潜力的技术，这对于推动可持续生物制造产业的发展具有重要意义。随着进一步的研究和优化，这种方法有望实现3-HP的低成本、大规模生产，为化工原料的绿色生产开辟新的道路。

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