天津科大代谢工程改造大肠杆菌高效合成L-异亮氨酸

科技 2024-10-19 16:30 上海

在全球化的医药和食品工业中，L-异亮氨酸作为一种必需的支链氨基酸，扮演着至关重要的角色。它在调节血糖稳态、肌肉蛋白合成、肝脏代谢和免疫反应等方面发挥着独特作用。随着市场需求的不断增长，传统的L-异亮氨酸生产方法已难以满足日益扩大的需求，因此，开发高效的L-异亮氨酸生产方法成为了科学研究的热点。

图1. 通过代谢工程在大肠杆菌中耦合生长生产 L-异亮氨酸

2024年10月14日，来自天津科技大学工业发酵微生物教育部重点实验室的张成林教授和夏梦雷副教授在《Metabolic Engineering》杂志发表了题为“Growth-coupled production of L-isoleucine in Escherichia coli via metabolic engineering”的研究论文，该团队通过代谢工程手段，成功在大肠杆菌中实现了与生长耦合的L-异亮氨酸生产。研究团队首先通过阻断L-异亮氨酸合成途径中关键酶的负反馈抑制实现了L-异亮氨酸的积累，之后，建立了一个α-酮丁酸生成旁路与L-异亮氨酸合成途径进行生长耦合，将L-异亮氨酸的产量提高至7.4克/升。通过适应性实验室进化获得的活性改进型半胱氨酸γ-合酶突变体，进一步提高了L-异亮氨酸产量至8.5克/升。此外，通过绕过依赖NADPH的天冬氨酸转氨酶途径，采用依赖NADH的途径和转氢酶，改善了氧化还原通量。最终，通过改良转运系统，增强了L-异亮氨酸的外排。在48小时的补料发酵后，得到的ISO-12菌株达到了51.5克/升的L-异亮氨酸产量和0.29克/克葡萄糖的产率，这一产量和产率均高于以往报道的任何菌株。

图2. 代谢工程改造大肠杆菌增强L-异亮氨酸生物合成

首先，研究人员通过阻断L-异亮氨酸合成途径中的关键酶，即苏氨酸脱水酶（TD）和乙酰羟酸合酶（AHAS），的负反馈抑制来增强L-异亮氨酸的积累。具体来说，通过在菌株ILE-2中引入对L-异亮氨酸负反馈抑制有抗性的TD突变体（ilvAYI），成功将代谢流向L-异亮氨酸引导，使得L-异亮氨酸产量提升至3.2克/升。进一步地，通过在该菌株中过表达抗反馈抑制的AHAS突变体（ilvBN^YI），代谢流向L-异亮氨酸的引导得到进一步加强，导致L-异亮氨酸产量显著增加至5.1克/升，同时α-酮丁酸的积累几乎无法检测到，表明代谢流有效地被引导至L-异亮氨酸的合成。

图3. 建立α-酮丁酸生成旁路耦合细胞生长与L-异亮氨酸合成

进一步，研究人员设计了一个基于metA-metB的α-酮丁酸生成旁路，通过阻断琥珀酸合成途径（删除sucCD和aceA基因）并补偿琥珀酸（通过过表达metA和metB），成功地将细胞生长与L-异亮氨酸生产联系起来。这种策略在ISO-4菌株中实现了细胞生长的恢复，并在ISO-5菌株中通过减弱L-半胱氨酸合成进一步促进了α-酮丁酸的生成，从而显著提高了L-异亮氨酸的产量至7.4克/升。

图4. 适应性进化筛选得到CGS突变体提高L-异亮氨酸产量

此外，通过适应性实验室进化筛选出的CGS突变体在M3菌株中表现出最高的特异性活性，比野生型提高了28.9%，这证实了通过增强CGS活性可以进一步提升L-异亮氨酸的生产。

图5. 分子动力学模拟分析CGS及其突变体活性增强机制

研究人员通过分子动力学模拟分析CGS及其突变体（CGS^M）的酶活性增强机制。研究发现，CGS^M对底物O-琥珀酰-L-高丝氨酸的亲和力更强，其K_m值降低至1.2 mM，k_cat/K_m值提高至5.3/mM/S，表明其催化效率更高。分子动力学模拟显示，CGS^M在活性位点附近的氨基酸残基具有更高的灵活性，其RMSF值较高，这有助于提高催化效率。此外，CGS^M的RG值降低至21.9 Å，SASA值也降低，表明其结构更加紧凑和稳定。CGS^M的结合口袋表面积和深度均大于CGS，这有助于更容易地结合底物。

图6. CGS突变体与底物相互作用对催化效率的影响

接着，研究人员深入分析了野生型CGS和其突变体CGS^M的结合口袋特性以及它们与底物O-琥珀酰-L-高丝氨酸的相互作用。模拟结果显示，CGSM在结合口袋入口处的S47到R49区域形成了一个更柔性的环状结构，降低了能量障碍，从而促进了底物的进入。此外，CGS^M的结合口袋表面积和深度均较CGS有显著增加，分别为1029.0 Å²和25.8 Å，表明CGS^M更容易与底物结合。特别是N148Y突变为CGS^M提供了额外的阳离子-π相互作用能力，进一步增强了对O-琥珀酰-L-高丝氨酸的捕获能力。这些结构和动力学特性的改进，使得CGS^M展现出更高的底物亲和力和催化效率。

图7. 通过改善氧化还原通量增强L-异亮氨酸合成

进一步，研究人员通过改善氧化还原通量来增强L-异亮氨酸的合成。通过绕过依赖NADPH的天冬氨酸转氨酶途径，采用依赖NADH的途径和转氢酶，成功提高了细胞内NADPH/NADP⁺的比例。具体来说，通过在ISO-6菌株中过表达天冬氨酸氨苄酶(aspA)，NADPH/NADP⁺比例提高至0.42，L-异亮氨酸产量增加至9.5克/升，比ISO-6提高了11.8%。进一步地，通过在ISO-7菌株中表达NADH依赖的L-亮氨酸脱氢酶(bcd)替代依赖NADPH的支链氨基酸转氨酶(ilvE)，NADPH/NADP⁺比例进一步提升至0.51，L-异亮氨酸产量达到10.5克/升，比ISO-7提高了10.5%。最后，通过在ISO-8菌株中过表达吡啶核苷酸转氢酶(pntAB)，NADPH/NADP⁺比例提高至0.63，L-异亮氨酸产量进一步提升至11.7克/升，比ISO-8提高了11.4%。

图8. 通过改造转运系统促进L-异亮氨酸外排

研究人员之后通过改造转运系统来促进L-异亮氨酸外排。通过在ISO-9菌株中表达两种不同的支链氨基酸转运蛋白，ygaZH和brnFE，成功创建了ISO-10和ISO-11菌株。这些改造显著提高了L-异亮氨酸的产量，分别达到12.5克/升和13.6克/升，与ISO-9相比，产量分别提高了11.5%和21.3%。此外，通过敲除负责支链氨基酸摄取的brnQ基因，创建了ISO-12菌株，进一步减少了细胞内L-异亮氨酸的积累，并使产量提升至15.3克/升，比ISO-11提高了12.5%，表明通过协同促进L-异亮氨酸的外排和阻断其摄取，可以有效地增强L-异亮氨酸的生产。

图9. ISO-12菌株在5升发酵罐中生产L-异亮氨酸的性能

最后，研究人员使用ISO-12菌株在5升发酵罐中进行生产性能评估。在48小时的补料发酵过程中，ISO-12菌株的生物量逐渐增加，最高达到17.9克/升，而L-异亮氨酸的产量则从4小时的3.07克/升开始检测，并在发酵结束时达到51.5克/升的峰值。L-异亮氨酸的产率和生产率分别达到了0.29克/克葡萄糖和1.07克/升/小时。虽然在发酵后期观察到L-异亮氨酸的生产速率有所下降，这可能与生物量的减少和氮源等营养物质的耗尽有关。整个发酵过程中，常见的副产物如有机酸和氨基酸等均未检出，而L-缬氨酸的积累量在发酵结束后降至2.13克/升，为工业化生产提供了重要的参考数据。

总之，这项工作不仅在大肠杆菌中实现了高效生产L-异亮氨酸，而且为微生物细胞工厂的构建提供了新的思路和策略。通过耦合细胞生长和目标产物的生物合成，该团队成功地提高了L-异亮氨酸的生产效率，这对于降低生产成本、提高工业竞争力具有重要意义。此外，该研究中采用的代谢工程策略，为其他微生物代谢产物的高效生产提供了可借鉴的模式，有望推动合成生物学和生物制造领域的发展。

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