清华大学改造盐单胞菌高效合成γ-氨基丁酸和2-吡咯烷酮

科技 2024-09-07 16:30 上海

在现代社会，随着人们健康意识的提高，对功能性食品和药物的需求不断增长。其中，γ-氨基丁酸（GABA）作为一种非蛋白质氨基酸，因其在稳定情绪、改善睡眠质量和调节心血管功能等方面的重要作用而备受关注。目前，GABA的生产主要依赖化学合成、酶催化和微生物发酵等方法。其中，微生物发酵因其转化率高、操作简便和成本低等优势，成为了一种有效的GABA生产方式。此外，GABA也是合成2-吡咯烷酮的重要前体，后者作为尼龙-4的单体，具有高热稳定性、可生物降解性和防水性，是化学工业的重要原料。

图1. 代谢工程改造盐单胞菌高效合成γ-氨基丁酸和2-吡咯烷酮

2024年9月5日，来自清华大学生命科学学院合成与系统生物学研究中心的陈国强教授在《Bioresource Technology》杂志发表了题为“Engineered Halomonas for production of gamma-aminobutyric acid and 2-pyrrolidone”的研究论文，该团队通过代谢工程手段成功改造了盐单胞菌Halomonas bluephagenesis，实现了一步法生物合成GABA和2-吡咯烷酮。通过过表达GABA和2-吡咯烷酮合成的关键基因，并删除GABA降解基因，同时减少2-吡咯烷酮前体的降解，显著提高了GABA和2-吡咯烷酮的产量。改造后的H. bluephagenesis菌株WLp07在全细胞催化中，能够产生高达357 g/L的GABA和72%重量百分比的聚羟基脂肪酸酯（PHA）。此外，通过自絮凝H. bluephagenesis，实现了细胞的快速、便捷回收，经过三个循环后，GABA的产量达到了创纪录的880 g/L。

图2. 异源调控表达gadB对H. bluephagenesis TD1.0合成GABA的影响

研究人员构建了含有优化和未优化gadB基因的表达载体pZG01/02，并将其转入H. bluephagenesis TD1.0中，得到了重组菌株Tp01和Tp02。使用单钠谷氨酸作为底物进行发酵实验，结果显示，未优化的gadB基因产生的GABA浓度为10.8 g/L，而优化后的gadB基因则显著提高了GABA的产量，达到了13.9 g/L，接近100%的转化率。此外，通过改变IPTG的诱导浓度，发现在10 mg/L IPTG条件下，Tp02菌株的GABA产量最高。

图3. 通过敲除GABA降解基因增强GABA合成

由于H. bluephagenesis TD1.0在含有30 g/L GABA的培养基中可以自主消耗GABA，因此，研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑技术分别敲除了参与GABA降解途径的gabT1、gabT2和gabT3基因，并测试了不同敲除组合对菌株生长和GABA产量的影响。结果显示，敲除gabT1和gabT2基因的重组菌株TGp02，在含有L-Glu的发酵培养基中，GABA产量显著提高至近30 g/L，而对细胞生长和PHA积累没有负面影响。这些结果表明通过基因编辑敲除GABA降解关键基因，可以有效减少GABA的消耗，从而提高H. bluephagenesis TD1.0的GABA生产能力。

图4. GABA生物合成转化系统的优化

接下来，研究人员通过优化发酵条件增强H. bluephagenesis TGp02菌株合成GABA。研究人员考察了不同pH值对GABA产量的影响，发现在pH 3.0至5.0的酸性条件下，GABA的产量显著增加，而在中性或碱性条件下，GABA的合成几乎停止。其次，通过调整底物添加时间，发现在发酵24小时后添加底物，可以最大程度地提高GABA的产量，这是因为此时细菌生长达到平台期，积累了更多的催化酶GadB。此外，研究还确定了L-Glu的最佳底物浓度为80 g/L，在此浓度下，经过12小时的转化，可以得到51.4 g/L的GABA。最后，通过调整尿素浓度，发现在1 g/L尿素条件下，可以获得最高的GABA产量59.8 g/L。

图5. 工程改造的H. bluephagenesis全细胞催化合成GABA

进一步，研究人员利用基于毒素-抗毒素系统的稳定表达载体pHbPBC，构建了表达gadB基因的重组菌株WLp06/07/08，并发现中等强度的P_porin183/226启动子足以产生足够的GadB，从而在摇瓶实验中实现了63.1 g/L的GABA产量和97.4%的转化率。在7L生物反应器中，通过优化发酵条件，TGp02和WLp07菌株分别在22小时后产生了250.4 g/L和357.2 g/L的GABA，同时细胞内PHA含量分别达到了47.0%和72.2%。此外，通过利用自絮凝的H. bluephagenesis WZY278ΔEPS菌株WEp02，研究人员展示了细胞的循环利用能力，在摇瓶实验中实现了至少五次的循环利用，而在7L生物反应器中，通过三个循环的利用，总GABA产量达到了879.6 g/L。

图6. 工程改造的H. bluephagenesis生物合成2-吡咯烷酮

最后，研究人员引入了来自Anaerotignum propionicum的β-丙氨酸辅酶A转移酶（Act）来合成2-吡咯烷酮，该酶具有显著的活性和从GABA到2-吡咯烷酮的高转化效率。通过构建表达载体pSEVA321-P_Mmp1-act_WT/act_opt，即pZG09/10，并将其转入H. bluephagenesis TD1.0ΔgabT1/2菌株，得到了重组菌株TGp09/10。在优化了IPTG诱导浓度后，使用30 g/L GABA作为底物，TGp09菌株成功产生了6.3 g/L的2-吡咯烷酮，并在细胞干重中实现了48.3%的PHA共生产。尽管直接从L-Glu合成2-吡咯烷酮未能成功，可能是因为Act在GadB活性所需的酸性条件下失活，但使用GABA发酵液和纯GABA可以获得类似的2-吡咯烷酮产量，表明2-吡咯烷酮和GABA作为细胞外小分子产物，可以与细胞内的PHA进行共生产。

总之，这项工作通过利用可再生资源，减少对化学合成方法的依赖，为生产高附加值的生物基化学品提供了一种环保且高效的解决方案。该研究不仅在生物合成领域取得了重要进展，而且对于推动可持续生产和生物基材料的发展具有深远的意义。随着技术的进一步优化和规模化应用，有望在医药、食品和材料等多个领域实现GABA和2-吡咯烷酮的低成本、大规模生产，为社会带来更加健康、环保的产品选择。

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