江南大学代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌高效合成L-丙氨酸

科技 2024-09-26 16:31 上海

在全球化石燃料日益枯竭和环境污染问题日益严峻的背景下，通过生物制造方法生产氨基酸，特别是L-丙氨酸，成为了科学研究的热点。L-丙氨酸作为必需氨基酸之一，在制药、食品添加剂和营养补充剂等行业具有重要价值。传统的化学合成方法依赖于石油产品，存在环境污染和资源限制的问题。因此，开发可持续和高效的生产方法，通过微生物发酵将可再生原料转化为L-丙氨酸，成为了科学研究的重点。

图1. 谷氨酸棒状杆菌中L-丙氨酸生物合成途径

2024年9月24日，来自江南大学工业生物技术教育部重点实验室的王小元教授在《Systems Microbiology and Biomanufacturing》杂志发表了题为“Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for L-alanine production”的研究论文，该团队通过代谢工程技术改造了谷氨酸棒状杆菌，成功增强了L-丙氨酸的生产。研究团队构建了多个工程菌株，如ΔfasB、ΔfasBR、ΔfasBΔpks13和ΔfasBRΔpks13，这些菌株的L-丙氨酸产量最高可达17.29 g/L。与先前研究中从谷氨酸棒状杆菌ATCC13032构建的ΔfasB突变株不同，该研究中的ΔfasB突变株显著产生L-丙氨酸而不积累L-谷氨酸。转录组分析显示，敲除fasB基因上调了与L-丙氨酸合成相关的基因表达，而下调了与脂肪酸合成相关的基因，证实了代谢通量从脂肪酸合成转向L-丙氨酸合成。通过组合表达异源基因alaD（编码丙氨酸脱氢酶）和alaE（编码丙氨酸出口蛋白），L-丙氨酸产量进一步提高，ΔfasB和ΔfasBR的产量分别达到55.21 g/L和54.95 g/L。最终，在补充葡萄糖的ΔfasB/pJYW-5-alaDE菌株中，经过60小时发酵，获得了69.9 g/L的L-丙氨酸产量。

图2. 不同菌株的生长、葡萄糖消耗和 L-丙氨酸产量比较

研究人员首先比较了不同工程菌株中L-丙氨酸的生产情况，包括对生长曲线、葡萄糖消耗和L-丙氨酸产量的分析。研究发现，敲除fasB基因对细胞生长的影响很小，但对L-丙氨酸的产量有显著影响。具体来说，ΔfasB和ΔfasBR在30小时时L-丙氨酸产量分别达到13.61 g/L和13.98 g/L的峰值，但之后迅速下降。相比之下，ΔfasBΔpks13突变株在39小时时L-丙氨酸产量显著增加至17.29 g/L，并且在45小时时虽然有所下降，但仍然保持较高产量。此外，ΔfasBRΔpks13突变株在36小时时达到了14.13 g/L的最高产量。这些数据表明，通过敲除关键基因并优化发酵条件，可以显著提高L-丙氨酸的产量。

图3. 不同菌株中与L-丙氨酸和脂肪酸生物合成相关基因的RT-PCR分析

接下来，研究人元通过实时定量PCR (RT-PCR) 分析揭示了不同基因敲除菌株中与L-丙氨酸生物合成和脂肪酸合成相关基因的表达情况。研究发现，敲除fasB基因后，丙氨酸生产相关基因alaT和avtA的表达水平显著上调，而脂肪酸合成相关基因accBC和accD2以及蜡酸合成基因pks13的表达水平下调。在ΔfasBR菌株中，缺少转录调控因子FasR导致与脂肪酸合成相关的基因表达下调，只有alaT基因表达上调。在ΔfasBΔpks13菌株中，FasR因子的相对表达水平没有上调，但fasA基因表达显著下调，这可能与细胞内过量的酰基辅酶A（acyl-CoA）有关。此外，与L-谷氨酸合成相关的关键基因gdhA、gltB和MscCG在ΔfasBΔpks13菌株中表达下调，这与观察到的L-谷氨酸产量减少相一致。这些结果表明，通过基因编辑改变特定基因的表达，可以有效地调节代谢通量，从而增强L-丙氨酸的生产。

图4. ΔfasB 和ΔfasBR 中与 L-丙氨酸生物合成相关的关键基因表达水平比较

研究人员通过在ΔfasB和ΔfasBR菌株中引入异源表达基因来提升L-丙氨酸的产量。研究发现，引入来自枯草杆菌的丙氨酸脱氢酶基因alaD和大肠杆菌的丙氨酸转运蛋白基因alaE，可以显著提高L-丙氨酸的产量。具体来说，ΔfasB/pJYW-5-alaD和ΔfasBR/pJYW-5-alaD在36小时时分别产生了45.61 g/L和44.42 g/L的L-丙氨酸，远高于对照菌株。此外，引入alaE基因虽然对菌株生长有负面影响，但同样提高了L-丙氨酸的产量，例如ΔfasB/pJYW-5-alaE在36小时时产量达到了16.87 g/L。然而，同时表达alaD、alaE和ED途径关键酶edd和eda的菌株ΔfasB/pJYW-5-alaDE-eddeda并没有表现出比单独表达alaD更好的产量，反而产量有所下降。这些结果强调了在代谢工程中，选择合适的异源基因表达对于提高目标代谢产物的产量至关重要。

图5. ΔfasB 和 ΔfasBR 中与 L-丙氨酸生物合成相关的关键基因共表达比较

研究人员进一步探讨了在ΔfasB和ΔfasBR菌株中共表达关键基因对L-丙氨酸产量的协同影响。研究中构建了不同的表达载体，以共表达丙氨酸脱氢酶基因alaD和丙氨酸转运蛋白基因alaE，以及ED途径的关键酶edd和eda。结果显示，在ΔfasB菌株中，alaD和alaE的共表达显著提升了L-丙氨酸的产量，达到了55.21 g/L，比单独表达alaD的菌株高出5 g/L。然而，尽管alaD、alaE和edd、eda的共表达在理论上可以增强ED途径，实际上却导致了L-丙氨酸产量的下降。在ΔfasBR菌株中观察到了类似的趋势，共表达alaD和alaE同样可以提高L-丙氨酸的产量至54.95 g/L，但共表达alaD、alaE、edd和eda却未能进一步提升产量。这些结果表明，虽然共表达多个异源基因可以增强代谢通量，但并非所有基因组合都能带来预期的产量提升，强调了在代谢工程中需要仔细选择和优化基因表达组合的重要性。

图6. ΔfasB/pJYW5-5-alaDE 在不同条件下的发酵情况

最后，研究人员通过优化发酵条件在ΔfasB/pJYW-5-alaDE菌株中进一步提升L-丙氨酸产量。在摇瓶发酵中补充葡萄糖后，该菌株在48小时L-丙氨酸的产量达到了67.83 g/L，并在60小时进一步提高至69.9 g/L。这一产量是在优化了葡萄糖浓度后实现的，表明了及时补充碳源对于提高产量的重要性。在5升生物反应器中进行的分批发酵实验中，ΔfasB/pJYW-5-alaDE菌株表现出了优异的生长特性和产品形成能力，在80小时时L-丙氨酸的产量达到了67.35 g/L。这些结果证实了通过优化发酵条件和培养基组成，可以显著提高工程菌株的生产能力，为工业规模生产L-丙氨酸提供了有力的实验依据。此外，这些发现也揭示了工程菌株在利用碳源进行生长与生产之间的平衡，为未来进一步提高产量提供了潜在的代谢工程靶点。

总之，这项研究不仅提供了一种新的策略来提高谷氨酸棒状杆菌中L-丙氨酸的产量，而且为工业生物技术中的菌株工程提供了宝贵的见解。该工作展示了通过敲除脂肪酸生物合成途径来重定向代谢通量向L-丙氨酸生物合成的潜力，不仅有助于减少对石油衍生化学品的依赖，还为实现绿色和可持续的生物经济提供了新的可能性，为未来可持续生物制造领域的发展奠定了坚实的基础。

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