南昌大学改造微藻合成角黄素和二十碳五烯酸

科技 2024-09-30 16:30 上海

通过生物制造方法生产高价值化合物，正逐渐成为科学研究的新焦点。角黄素作为一种天然色素，在食品着色、保健品和化妆品等领域具有重要应用；二十碳五烯酸（EPA）作为一种ω3多不饱和脂肪酸，在医药保健和食品工业中具有不可替代的作用。然而，传统的化学合成方法不仅消耗石油资源，还可能带来环境污染问题。因此，开发一种可持续、环保且高效的生产方式，利用微生物发酵技术将可再生原料转化为角黄素和EPA，正成为科学研究的重要方向。

图1. 代谢工程改造海洋微拟球藻高效合成角黄素和EPA

2024年9月23日，来自南昌大学资源与环境学院的刘进教授在《Bioresource Technology》杂志发表了题为“Engineering Nannochloropsis oceanica for concurrent production of canthaxanthin and eicosapentaenoic acid”的研究论文，该团队通过在海洋微拟球藻的叶绿体中表达来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶基因，成功构建了能够大量合成角黄素的工程藻株。与野生型相比，改造后的藻株在高光照下表现出更好的生长性能，并且EPA含量也有所提升。进一步通过增强类胡萝卜素合成途径的流量或抑制竞争途径，使得角黄素含量显著增加，最高可达4.7 mg/g干重。此外，通过优化培养策略，实现了在10天内角黄素和EPA的共生产，分别达到37.6 mg/L和268.8 mg/L。这一成果不仅提高了微拟球藻的工业应用价值，还为从CO₂中高效生产高价值生化产品提供了新思路。

图2. 转基因株在高光照条件下的生长和角黄素积累

研究人员首先探究了在高光照条件下，过表达β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)的藻株相较于野生型在生长和角黄素积累方面的优势。其中，CrBKT的转录表达水平在工程藻株中得到了显著提升，而这一遗传改造直接促进了角黄素的生物合成。在350 μmol photons m⁻² s⁻¹的光照条件下培养6天后，工程藻株BKT-2的干重生物量达到了4.5 g/L，显著高于野生型的生物量。与此同时，BKT-2的角黄素含量在培养第4天达到了峰值，为3.4 mg/g，远高于野生型的0.2 mg/g。此外，通过分析发现，干重生物量与角黄素含量之间存在正相关关系，表明角黄素的积累有助于提高藻株在高光照条件下的生长性能。

图3. 不同光照条件下WT和BKT-2菌株的生长参数、叶绿素a含量和ROS水平

接下来，研究人员探讨了不同光照强度对海洋微拟球藻野生型和BKT-2工程藻株生长和色素组成的影响。在正常光照和中等光照条件下，BKT-2与WT的生长差异不大，然而在高光照条件下，BKT-2的生长显著优于野生型，其干重生物量浓度明显更高。此外，BKT-2在所有光照条件下都显示出比野生型更高的叶绿素a含量，并且在高光照条件下，BKT-2的光系统II最大量子产量(Fv/Fm)显著高于野生型，表明其在高光照下保持了较好的光合作用性能。同时，BKT-2在高光照条件下的活性氧(ROS)水平比野生型低，这暗示了角黄素在清除细胞内ROS、缓解光合作用损伤和促进高光照下藻类生长中的潜在保护作用。在色素组成方面，BKT-2显示出比野生型更高的总类胡萝卜素(TC)含量，并且在所有测试的光照条件下，BKT-2的酮类胡萝卜素产量都显著高于野生型，尤其是在高光照条件下，BKT-2的角黄素产量可达到8.5 mg/L，远高于正常光照或中等光照条件下的产量。

图4. CrBKT过表达对海洋微拟球藻内源类胡萝卜素生物合成基因转录表达的影响

进一步，研究人员通过热图形式展示了过表达CrBKT对海洋微拟球藻内源类胡萝卜素生物合成相关基因转录水平的影响。研究表明，无论是在正常光照还是高光照条件下，与野生型相比，BKT-2工程藻株中这些基因的转录水平仅有轻微变化，且变化倍数都小于1.4。这一结果暗示着BKT-2中类胡萝卜素含量的显著增加并不依赖于 MEP 途径或类胡萝卜素生物合成途径在转录水平上的显著上调。这可能表明这些途径在转录水平上已经达到饱和状态，或者其调控可能发生在转录后水平。

图5. 不同光照条件下WT和BKT-2菌株的脂质组成

研究人员揭示了在正常光照（NL）和高光照（HL）条件下，海洋微拟球藻野生型和BKT-2工程藻株的脂质组成分析结果。在高光照条件下，WT和BKT-2的总脂肪酸(TFA)和三酰甘油(TAG)含量都有所增加，而极性膜脂质(PML)水平则有所下降。然而，BKT-2相较于WT显示出更低的TFA和TAG水平，但PML水平更高，表明BKT-2在高光照下受到的胁迫更小。此外，BKT-2在NL和HL条件下的单半乳糖二酰基甘油和二半乳糖二酰基甘油含量都高于WT，这两种脂质中的EPA相对丰度在BKT-2中也显著高于WT，尤其是在HL条件下。在EPA含量方面，BKT-2的干重EPA含量比WT高出30.4%，这表明角黄素有助于防止高光照下EPA的降解，使得BKT-2的EPA含量更高。在EPA产量方面，BKT-2在HL条件下的产量显著高于NL条件下，与WT相比，BKT-2在HL条件下的EPA产量提高了92.8%。这些结果表明，通过遗传工程手段提高角黄素含量的海洋微拟球藻藻株在高光照条件下能够更有效地合成EPA。

图6. 在BKT-2中通过多基因工程增加角黄素生物合成

研究人员通过多基因工程进一步增强海洋微拟球藻中角黄素的生物合成。通过在BKT-2藻株中过表达GGPPS基因或敲低ZEP1基因，实现了对角黄素含量的调控。实验数据显示，过表达GGPPS的BG-1和BG-2藻株，以及敲低ZEP1的Bz-1和Bz-2藻株，其角黄素含量分别达到了4.0 mg/g和4.7 mg/g干重，相较于BKT-2藻株的3.4 mg/g干重有显著提升。然而，GGPPS过表达和ZEP1敲低的组合(BGz-1和BGz-2)并未带来额外的积累效果。这些结果表明，通过调节特定基因的表达，可以有效地增加微藻中角黄素的含量。

图7. 通过分批补料培养策略共生产角黄素和EPA

最后，研究人员通过优化培养策略实现Bz-1工程藻株共生产角黄素和EPA。在为期10天的分批培养中，Bz-1藻株在第2至4天达到最大生物量积累，但随着培养时间的延长，由于氮和磷等营养物质的消耗，生长受到抑制。通过在第4、6和8天补充硝酸盐和磷酸盐的分批补料发酵策略，Bz-1的生物量浓度最终达到9.7 g/L，比分批培养高出51%。最终，角黄素和EPA的产量在第10天分别达到了37.6 mg/L和268.8 mg/L。特别是在培养的第2至4天，角黄素和EPA的生产力分别达到了5.8 mg/L/天和44.9 mg/L/天的峰值。此外，角黄素和EPA的产量之间呈现出高度正相关，表明这两种化合物的生物合成是并行进行的。这些发现不仅证实了通过代谢工程改造的微藻可以有效地共生产两种高价值化合物，还为未来微藻生物技术的工业应用提供了重要的参考依据。

总之，这项工作不仅展示了通过合成生物学手段提升微藻经济价值的潜力，还为未来实现可持续的生物制造和碳中和目标提供了新的策略。通过微藻生产高价值的生化产品，不仅可以减少对传统资源的依赖，还能促进环境保护和生态平衡，这对于推动绿色经济和实现可持续发展具有重要意义。随着技术的不断进步和成本的降低，预计未来微藻生物技术将在食品、饲料、化妆品和医药等多个领域发挥更加重要的作用。

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